尚 忠,唐 磊,2,王连慧,黄 海,茅云翔,莫照兰,2❋❋
(1. 中国海洋大学三亚海洋研究院,海南省热带水产种质重点实验室,海南 三亚 572024;2. 中国海洋大学海洋生命学院,海洋生物遗传育种教育部重点实验室,山东 青岛 266003;3. 海南热带海洋学院水产与生命学院,热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室,海南 三亚 572022)
多纹钱蝶鱼(Selenotocamultifasciata)俗称银鼓鱼,属鲈形目(Perciformes)鲈亚目(Percoidei)金钱鱼科(Scatophagidae)钱蝶鱼属(Selenotoca),是广温、广盐、偏植食性的海水杂食性鱼类。由于其生长快、肉质细嫩、易于饲养,兼具观赏和食用价值等特点,深受广大养殖户和消费者喜爱,具有较高的经济价值。海南的地理环境优势使其成为多纹钱蝶鱼种苗生产和养殖主产区,鱼苗的规模化养殖在海南陵水,其大部分鱼苗向广西、广东、福建、湖北等地推广,其已经成为海南的一项亿级产业。目前广东、广西、福建及浙江等地也开始在网箱和池塘中大量养殖。根据本实验室前期的流行病学调查发现,海南多纹钱蝶鱼养殖场海豚链球菌病频发,从而引起该鱼大量死亡,给养殖场造成了严重的经济损失。为保障该产业的稳定持续发展,亟需开展多纹钱蝶鱼海豚链球菌病的防控技术研究。
海豚链球菌(Streptococcusiniae)属芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)链球菌科(Streptococcaceae)链球菌属(Streptococcus),是兼性厌氧型革兰氏阳性球菌。该菌能够使鱼类感染链球菌病(Streptococcosis),病鱼通常表现为眼球突出充血、体色发黑、游动失衡、缺氧、不摄食等,但也有部分鱼感染后迅速死亡,几乎无任何临床症状[1-3]。在我国已报道发生海豚链球菌病的鱼类有罗非鱼(Oreochromismossambicus)[4]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5]、鲟鱼(Acipensersinensis)[6-7]、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)[8]、多纹钱蝶鱼[9-10]等。海豚链球菌分为两种血清型,Ⅰ型菌株主要引起神经症状,Ⅱ型可导致全身性脓毒性疾病,且体内弥散性出血[11]。当前针对鱼类海豚链球菌病的防治主要依赖抗生素药物和疫苗免疫。由于抗生素会导致病原菌耐药性产生,因此疫苗是控制水产养殖链球菌病发生与流行最为有效的途径。国内外已开展了多种海豚链球菌疫苗的研究,包括灭活疫苗[12-14]、减毒活疫苗[15-16]、亚单位疫苗[17-18]以及DNA疫苗[19-20]。灭活疫苗因其安全性高和易于制备等特点在水产养殖应用的商品疫苗中占绝大多数。
本研究进行了海南多纹钱蝶鱼链球菌病的调查,开展了海豚链球菌不同地理株的血清型、耐药性、致病性研究,评价了不同菌株灭活疫苗的免疫保护效果,并进一步评价了1株强毒株的交叉免疫保护效果。获得的研究结果将为多纹钱蝶鱼链球菌疫苗研发打下基础。
1.1 实验材料
1.1.1 实验用鱼 用于病原分离的患病多纹钱蝶鱼,取自2021年10月海南省陵水黎族自治县某养殖场、2022年5月海南省东方市某养殖场,鱼体长为8.00～15.00 cm、体质量为10.0～70.0 g。用于毒力测定及疫苗免疫实验的多纹钱蝶鱼,购自海南东方某养殖场,平均体长为(10.00±1.00) cm,平均体质量为(20.0±5.0) g,在实验室养殖箱(45 cm×33 cm×30 cm)中持续充气暂养,养殖水温(25±1) ℃,盐度30±1,每天换水50%。
1.1.2 实验菌株 链球菌菌株LSSM分离自海南陵水黎族自治县养殖场患病的多纹钱蝶鱼,DFSM分离自海南东方市养殖场患病的多纹钱蝶鱼,GXTO分离自广西患病的卵形鲳鲹,GXAS分离自广西养殖场患病的鲟鱼,以上菌株名称均为首次命名。所有菌株在-80 ℃保藏。
1.1.3 实验试剂 脑心浸液(Brain heart infusion,BHI)培养基和Muller-Hinton agar(M-H)培养基购自北京索莱宝科技有限公司;革兰氏染色试剂购自青岛海博生物技术有限公司;羊血琼脂平板培养基购自北京陆桥技术有限公司;药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司;PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司;引物合成由上海生工生物工程有限公司完成;甲醛溶液购自国药集团化学试剂公司。
1.2 病害调查及海豚链球菌的分离鉴定
1.2.1 病害调查 于2021年10月在海南省陵水黎族自治县某养殖场、2022年5月在海南省东方市某养殖场开展了多纹钱蝶鱼的养殖病害调查,记录了养殖模式、水质条件、发病时间和死亡情况等数据。
1.2.2 细菌的分离培养和形态观察 每次调查取5～10尾濒死病鱼,观察记录病鱼的典型症状,无菌条件下对濒死病鱼进行解剖,取其肝脏、脾脏及肾脏划线接种BHI平板,28 ℃培养箱倒置培养24～72 h,挑取优势菌进行纯化,获得纯化菌株。将纯化的菌株接种于BHI平板上,28 ℃培养72 h后观察菌落形态;挑取单菌落制备成菌悬液滴于羊血平板,于28 ℃倒置培养48 h,观察溶血环;将制备的菌悬液滴片后进行革兰氏染色镜检。
1.2.3 细菌的16S rDNA序列测定与分析 采用细菌的16S rDNA通用引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1 492R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’扩增菌株的16S rDNA序列。目的条带送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果经NCBI的Blast检索系统(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对和同源性分析,选取海豚链球菌以及近缘种等相关序列,利用MEGA软件进行多重排列并构建系统发育树,重复数1 000次,用Neibor-Joining方法绘制进化树。
1.3 血清型鉴定
参考Bachrach等[11]的方法,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)确定海豚链球菌菌株的血清型。引物为LP:5’-GATCAAGTCC-3’。可以扩增出750 bp目的条带的菌株判定为血清Ⅰ型,没有该条带的判定为血清Ⅱ型。
1.4 耐药性试验
采用K-B纸片扩散法[21]对海豚链球菌菌株进行30种常用抗生素的药敏实验。取1×108CFU/mL的菌液100 μL均匀涂布于M-H培养基平板上,用无菌镊子取药敏纸片轻轻贴附于平板上,28 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径,实验设置3个平行,取平均值。根据CLSI M100抗菌药物敏感性试验性能标准以及药敏纸片说明书,确定海豚链球菌对各种抗生素的敏感性(S:高度敏感、I:中度敏感、R:不敏感或耐药)。
1.5 人工感染实验
将4株海豚链球菌培养液进行10倍稀释,制备107、106、105、104、103CFU/mL稀释度的菌悬液。将健康多纹钱蝶鱼随机分组,每组20尾。进行攻毒实验时,取不同稀释度的菌悬液注射鱼背部肌肉,注射剂量0.1 mL/尾,对照组注射0.1 mL/尾的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)。实验期间,养殖水温(25±1) ℃,2 d换一次水,每次换水50%。注射后每天记录发病症状和死亡情况,连续观察7 d,并对病鱼进行细菌的分离,统计累计死亡率,根据改良的寇氏标准法[22]计算半数致死量(LD50)。
1.6 海豚链球菌灭活疫苗免疫保护率的测定
1.6.1 灭活疫苗的制备和安全性检测 将3株海豚链球菌(DFSM、LSSM和GXTO)用BHI液体培养基培养至OD600>0.5,然后加入甲醛溶液至终浓度为0.20%(v/v),该浓度为实验室前期筛选(结果见附录A),在160 r/min、28 ℃灭活。灭活24 h后,吸取100 μL灭活菌液在BHI培养基上分别进行平板涂布和液体培养,检测灭活情况。进行安全性检测时,取灭活的菌液腹腔注射多纹钱蝶鱼,10尾/组,0.1 mL/尾,对照组注射0.1 mL/尾的PBS。实验鱼在正常养殖条件下观察7 d,记录症状及死亡情况。用灭菌PBS将灭活彻底、安全性合格的海豚链球菌灭活疫苗调节至OD600=0.5(浓度为1×108CFU/mL),放置4 ℃冰箱备用。
1.6.2 灭活疫苗的免疫保护率 将健康多纹钱蝶鱼随机分组,20尾/组,取1.6.1制备的灭活疫苗对鱼进行免疫,腹腔注射,注射剂量0.1 mL/尾,免疫对照组注射0.1 mL/尾的BHI培养基,空白对照组注射0.1 mL/尾的无菌PBS溶液。免疫7 d后进行攻毒实验,各组分别肌肉注射浓度为1 LD50的同源菌株。攻毒后观察实验鱼症状、死亡情况等,统计累积死亡数,计算相对免疫保护率:相对免疫保护率=(1-免疫组死亡率÷对照组死亡率)×100%。本实验进行两次重复。
1.6.3 DFSM灭活疫苗的交叉免疫保护率 同1.6.2步骤,以LSSM、GXTO为毒株,对DFSM免疫组鱼进行攻毒,计算相对免疫保护率。
2.1 病害调查及病原菌的分离鉴定
2021年10月海南省陵水黎族自治县某养殖场、2022年5月海南省东方市某养殖场爆发了多纹钱蝶鱼病害。2个养殖场该鱼的养殖面积均在350～400 m2,有水泥池和户外土塘2种养殖模式。发病时养殖水温为28～30 ℃,盐度为30±2,pH为7.8±0.2,溶解氧为(5.5±0.5) mg/L。陵水养殖场发病鱼规格在8.0 cm左右,体质量10.0 g左右,死亡率达20%;东方养殖场发病鱼规格在15.0 cm左右,体质量70.0 g左右,死亡率达70%。发病鱼死亡前均离群、狂游、身体失衡、不摄食,外观如图1A—1D所示,表现为体色发黑,鱼鳍基部、吻端发红,眼球浑浊突出且充血,肛门红肿;解剖症状如图1E、1F所示,内脏器官粘连严重、有腹水、肝脏发白、有病斑。
(A: 发红的鳍基; B: 发红的吻端; C: 突出充血的眼球; D: 红肿的肛门; E: 粘连的内脏器官; F: 发白的肝脏。A: Reddish fin base; B: Reddish snout; C: Prominent congested eyeballs; D: Red and swollen anus; E: Adhesive visceral organs; F: White liver.)图1 自然发病多纹钱蝶鱼的临床症状Fig.1 Clinical symptoms of the naturally diseased S. multifasciata
在海南陵水黎族自治县和东方市2个不同养殖场患病濒死的多纹钱蝶鱼的肝脏、脾脏和肾脏分离得到2株优势菌,分别命名为LSSM和DFSM。2株分离菌株均在BHI平板上得到形态大小一致、呈乳白色的菌落(见图2A和2D)。取优势菌落在羊血平板培养,菌落周围出现透明的β溶血圈(见图2B和2E)。在显微镜下观察,分离菌株呈链状球菌、革兰氏染色阳性(见图2C和2F)。
(A—C: 菌株LSSM的特征; D—F: 菌株DFSM的特征; A和D: BHI平板上的分离菌落形态特征; B和E: 羊血平板上的β溶血圈; C和F: 革兰氏染色阳性。A—C: Characteristics of strain LSSM; D—F: Characteristics of strain DFSM; A and D: Morphological characteristic of colony of isolated strains on BHI plate; B and E: β hemolytic circle on sheep blood plate; C and F: Gram positive staining result.)图2 分离菌株的形态特征及溶血性Fig.2 Morphological characteristics and hemolysis of isolated strains
对这2株菌株(LSSM和DFSM)与实验室保藏菌株(GXTO和GXAS)的16S rDNA基因序列进行扩增和测序,得到的序列经过Blast同源性检索,发现其与海豚链球菌同源性最高,相似性为99%。从中选取亲缘关系相近的序列,利用MEGA软件进行序列同源性分析和构建系统发育树(见图3),结果显示4株菌与海豚链球菌聚为一支。经形态学与分子生物学鉴定,确定这4株菌均为海豚链球菌(S.iniae)。
图3 菌株16S rDNA的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of stains
2.2 海豚链球菌的血清型鉴定结果
RAPD分型电泳图结果显示(见图4),4株海豚链球菌(LSSM、DFSM、GXTO和GXAS)均可以扩增出750 bp的目的条带(见图4泳道1—4中方框圈出部分)。根据Bachrach等[9]建立的海豚链球菌的血清型划分的方法,这4株海豚链球菌鉴定为血清Ⅰ型。
(M: 指示DNA; O: 空白对照; 1: LSSM; 2: DFSM; 3: GXTO; 4: GXAS; N1: 副乳房链球菌; N2: 哈维氏弧菌; N3: 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种; N4: 假单胞菌; N5: 溶藻弧菌。M: Marker DNA; O: Blank control; 1: LSSM; 2: DFSM; 3: GXTO; 4: GXAS; N1: Streptococcus parauberis; N2: Vibrio harveyi; N3: Photobacterium damselae subsp. piscicida; N4: Pseudomonas adaceae; N5: Vibrio alginolyticus.)图4 海豚链球菌的RAPD分型电泳图Fig.4 RAPD typing electropherogram of S. iniae
2.3 海豚链球菌的药敏试验结果
对4株海豚链球菌菌株进行30种抗生素的药敏试验结果显示,所有菌株均对青霉素类(羧苄西林、苯唑西林等)、头孢类(头孢氨苄、头孢拉定、头孢曲松等)、四环素、红霉素、诺氟沙星、氯霉素、克林霉素等23种抗生素高度敏感,对丁胺卡那耐药。不同地理菌株之间对抗生素的敏感性存在差异:海南株LSSM、DFSM菌株对庆大霉素和卡那霉素抗生素耐药,而广西株GXTO、GXAS则对庆大霉素和卡那霉素敏感(见附录B的附表1)。
表1 海豚链球菌感染多纹钱蝶鱼的LD50测定Table 1 LD50 determination of S. multifasciata after infection of S. iniae
2.4 人工感染实验结果
以多纹钱蝶鱼为实验动物、以4株海豚链球菌为病原进行人工感染实验,检测菌株的毒力,实验结果如表1所示。
LSSM、DFSM和GXTO的LD50分别为3.40×106、7.20×102和2.72×103CFU/尾,表明这些菌株在多纹钱蝶鱼的毒力大小依次为:DFSM>GXTO>LSSM。在整个实验过程中,GXAS攻毒组仅死亡1尾,不能计算出LD50,判定为弱毒力或无毒力。
根据以上结果,选择具有明显毒力的3株菌株(DFSM、GXTO和LSSM)进行后续的疫苗免疫保护效果评估实验。
2.5 海豚链球菌灭活疫苗的免疫保护率
以3株海豚链球菌(DFSM、GXTO和LSSM)分别制备灭活疫苗,经腹腔注射途径免疫多纹钱蝶鱼,7 d后以同源菌株进行攻毒,攻毒浓度为1 LD50,测定各菌株提供的RPS。本实验进行了两次重复,攻毒后各组存活率如图5、6所示。在第一次实验中,攻毒7 d后,DFSM免疫组的累积死亡率为10%,对照组为70%;GXTO免疫组的累积死亡率为20%,对照组为65%;LSSM免疫组的累积死亡率为45%,对照组为75%。经计算得出,DFSM、GXTO和LSSM灭活疫苗提供的相对保护率分别为85.7%、69.2%和40.0%(见图5)。在第二次实验中,DFSM免疫组的累积死亡率为10%,对照组为65%;GXTO免疫组的累积死亡率为20%,对照组为70%;LSSM免疫组的累积死亡率为60%,对照组为90%。经过计算,DFSM、GXTO和LSSM灭活疫苗提供的相对保护率分别为84.6%、71.4%和33.3%(见图6)。
(RPS: 相对免疫保护率 Relative percent survival rate。)图5 实验1中同源菌株攻毒后多纹钱蝶鱼的存活率Fig.5 Survival rate of S. multifasciata after being challenged by homologous strains in Experiment 1
(RPS: 相对免疫保护率 Relative percent survival rate。)图6 实验2中同源菌株攻毒后多纹钱蝶鱼的存活率Fig.6 Survival rate of S. multifasciata after being challenged by homologous strains in Experiment 2
为检测DFSM株灭活疫苗提供的交叉免疫保护,以DFSM灭活疫苗免疫多纹钱蝶鱼,7 d后以异源菌株LSSM、GXTO进行攻毒,结果如图7所示。LSSM和GXTO异源攻毒后7 d,免疫组累积死亡率分别为10%和0,经计算得到的相对保护率分别为86.7%和100%。这个结果表明,DFSM灭活疫苗对LSSM和GXTO毒株具有很好的交叉免疫保护。
(RPS: 相对免疫保护率 Relative percent survival rate。)图7 DFSM疫苗免疫组多纹钱蝶鱼经异源菌株攻毒后的存活率Fig.7 Survival rate of the DFSM vaccinated S. multifasciata after infection by heterologous strains
海豚链球菌作为重要的淡水、海水生物的病原菌,能够感染多种经济鱼类。本研究对海南省两个地区的多纹钱蝶鱼养殖场暴发的病害进行调查,分离鉴定了2株海豚链球菌LSSM和DFSM,其引起的症状与罗璋等[9]和杨林狄等[10]研究报道一致。研究人员应用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)方法,将海豚链球菌分为Ⅰ型和Ⅱ型两种血清型[11]。研究人员针对鱼源海豚链球菌的血清型分型开展了相关工作,如黄婷等[23]将分离自广西养殖罗非鱼和卵形鲳鲹的22株海豚链球菌鉴定为血清Ⅰ型,麻强生等[24]将分离自甘肃省某养殖场杂交鲟(Acipenserschrenckii♀×Acipenserbaeri♂)的5株海豚链球菌鉴定为血清Ⅱ型。本研究将分离自海南多纹钱蝶鱼、广西卵形鲳鲹和鲟鱼的4株海豚链球菌均鉴定为血清Ⅰ型,因此我们推断海豚链球菌血清Ⅰ型为当前感染海南多纹钱蝶鱼的流行株。下一步工作需要持续开展流行病学调查,分离收集更多的临床菌株进行血清型分析,为选择合适菌株制备疫苗提供参考。
本研究的4株海豚链球菌均对大部分抗生素敏感,对丁胺卡那耐药。不同地理株对抗生素的敏感性存在差异,如海南株(DFSM、LSSM)对庆大霉素和卡那霉素耐药,而广西株(GXTO、GXAS)则对庆大霉素和卡那霉素敏感;DFSM和GXTO均对复方新诺明耐药,而LSSM和GXAS则对复方新诺明敏感。不同地理株产生耐药性的差异与养殖企业滥用抗生素有关。目前抗生素仍是我国水产养殖病害的主要防治措施,疫苗的开发与应用对于鱼类养殖绿色健康可持续发展显得尤为重要。
本研究通过人工感染实验比较了4株海豚链球菌对多纹钱蝶鱼的毒力。肌肉注射和腹腔注射病原是鱼类常用的人工感染方法。在预实验中,我们比较了两种注射方法的感染效果,发现肌肉注射较腹腔注射对鱼的刺激较小,可以减缓病程,利于发病症状的观察和半数致死量的计算,因此本研究采用肌肉注射方式进行攻毒实验。结果显示,在这4株海豚链球菌中,来源于多纹钱蝶鱼和卵形鲳鲹的3株菌(DFSM、LSSM和GXTO)表现出较强的毒力,而分离自鲟鱼的菌株(GXAS)没有毒力。多纹钱蝶鱼和卵形鲳鲹在海水环境养殖,鲟鱼在淡水环境养殖,我们认为是由于该菌株处在海水环境中,其生长或毒力受到影响的缘故,因此GXAS对多纹钱蝶鱼没有致病性。在本研究中,分离自多纹钱蝶鱼的东方分离株DFSM的毒力强于陵水分离株LSSM;杨林狄等[10]从广东地区患病多纹钱蝶鱼分离到的海豚链球菌的LD50为1×105CFU/尾,其毒力介于DFSM菌株和LSSM菌株之间,这些结果说明来源于同种宿主的不同地理株之间也存在毒力差异。海豚链球菌存在多种毒力因子,如荚膜多糖[25]、溶血素[26]、葡萄糖磷酸变位酶[27]等,不同的环境因子可能影响了这些毒力因子的表达和调控,进一步影响了病原菌的毒力。
鱼用灭活疫苗免疫接种途径有注射、浸泡、口服,其中注射途径获得的免疫效果最好。腹腔注射和肌肉注射是常用的两种注射接种方式。腹腔注射可以使疫苗抗原直接刺激鱼的头肾、脾脏等免疫器官,快速引起免疫应答和免疫反应,免疫效果好。通过肌肉注射的疫苗抗原需要通过血液循环呈递到鱼类的免疫系统,引起的免疫应答和免疫反应较慢,免疫效果较低。同时,与肌肉注射途径相比,腹腔注射不容易引起疫苗流失,可以保证免疫剂量的准确和稳定。因此,在实际应用中,腹腔注射常用于鱼用灭活疫苗的免疫接种,如吴明波[28]和Yan等[29]制备的鱼类病原菌灭活疫苗,采用腹腔注射途径,获得了良好的免疫效果。为了获得有效的免疫效果,在本研究中我们采用腹腔注射方式对多纹钱蝶鱼进行免疫接种。国内外已经报道了多种鱼类海豚链球菌灭活疫苗的研究和应用,例如,虹鳟(Oncorhynchusmykiss)海豚链球菌灭活疫苗使得虹鳟的死亡率由50%降至5%[12],杂交鲟海豚链球菌灭活疫苗的相对保护率可达到92.8%[30]。目前尚未有多纹钱蝶鱼疫苗的报道。本研究制备了3株海豚链球菌(DFSM、LSSM和GXTO)灭活疫苗,检测了它们为多纹钱蝶鱼提供的免疫保护率,并进一步检测了强毒株DFSM疫苗对异源菌株(LSSM、GXTO)的交叉免疫保护率。结果显示,3种灭活疫苗的免疫保护率在33.3%～85.7%之间,其中强毒株DFSM提供的免疫保护率最高。DFSM灭活疫苗对2株异源菌株LSSM和GXTO的交叉免疫保护分别为86.7%和100%。因此,DFSM株是制备海南多纹钱蝶鱼海豚链球菌灭活疫苗的理想候选株。
本研究从海南不同的养殖场的患病多纹钱蝶鱼中分离到2株病原菌LSSM和DFSM,经形态学和16S rDNA序列分析鉴定为海豚链球菌。与实验室保藏的海豚链球菌(GXTO和GXAS)血清型均为血清Ⅰ型,海南株LSSM和DFSM对庆大霉素和卡那霉素抗生素耐药,广西株GXTO和GXAS则对庆大霉素和卡那霉素敏感;菌株DFSM、GXTO和LSSM对多纹钱蝶鱼的半数致死量(LD50)分别为7.20×102、2.72×103和3.40×106CFU/尾,GXAS则没有表现毒力。使用3株有毒株(DFSM、GXTO和LSSM)制备的灭活疫苗对多纹钱蝶鱼进行免疫,各组免疫鱼对同源菌株的相对保护率分别为84.6%～85.7%、69.2%～71.4%和33.3%～40.0%;强毒株DFSM灭活疫苗对异源菌株LSSM和GXTO的交叉免疫保护率分别为86.7%和100%;DFSM株制备的海豚链球菌灭活疫苗对同源和异源菌株的免疫保护效果均较好。上述结果为多纹钱蝶鱼海豚链球菌病的防控和灭活疫苗的研发、应用奠定了基础。
附录A不同浓度甲醛对海豚链球菌的灭活
将3株海豚链球菌(DFSM、LSSM和GXTO)用BHI液体培养基培养至OD600>0.5,并调节OD600值基本一致。然后加入甲醛水溶液,使甲醛终浓度分别为0.10%、0.20%和0.30%,以28 ℃,140 r/min震荡灭活,分别在12、24、36和48 h取样进行灭活效果检测。3株海豚链球菌灭活菌液各取100 μL进行平板涂布,28 ℃倒置培养,观察48～72 h;取50 μL的菌液加到BHI液体试管中,摇菌培养24～36 h,观察有无细菌生长。
在28 ℃灭活温度下,3株菌株在0.10%、0.20%和0.30%甲醛浓度下,灭活12、24、36和48 h后,检测结果见附表1。结果表明,当甲醛终浓度在0.20%时,3株海豚链球菌可在12 h内被完全灭活。
附表1 不同浓度甲醛对海豚链球菌的灭活效果Supplementary table 1 Inactivation effect of different concentrations of formaldehyde on Streptococcus iniae
附录B
猜你喜欢 保护率海豚毒力 12种杀菌剂对三线镰刀菌的室内毒力测定云南化工(2021年6期)2021-12-21海豚汽车观察(2021年11期)2021-04-24阿维菌素与螺螨酯对沾化冬枣截形叶螨的毒力筛选及田间防效研究农药科学与管理(2019年6期)2019-11-23提高林场造林成活率和保存率的措施农家科技下旬刊(2019年8期)2019-10-08海豚的自愈术学生天地(2019年30期)2019-08-25牛脾转移因子联合核酸疫苗对虹鳟鱼IHN病的保护率影响研究当代水产(2019年6期)2019-07-25儿童接种水痘疫苗效果及影响因素探析健康必读·下旬刊(2018年7期)2018-10-22峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用吉首大学学报（自然科学版）(2015年3期)2016-01-29水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物基因hpaF与毒力相关华南农业大学学报(2015年5期)2015-12-04表皮葡萄球菌感染的相关毒力因子概述现代检验医学杂志(2014年5期)2014-02-02本文来源：http://www.triumph-cn.com/fanwendaquan/gongwenfanwen/2024/1113/128405.html