文 贾志春 王金娟* 张建伟 .新疆理工学院 新疆黑木耳工程技术研发中心 .阿克苏地区食品安全检测中心
新疆阿克苏本地的黑木耳品种作为富硒产品开发实验对象，在前期单因素实验的基础上，利用Box-Benhnken中心组合旋转实验和响应面分析法，确定了制备过程的(硒添加量、溶液pH、灭菌温度) 最适工艺条件。结果表明，制备富硒木耳的最佳工艺为：硒添加量102ug/g、溶液pH7.9、灭菌温度100℃。在此工艺条件下，子实体总硒含量可达110.1mg/kg。通过在黑木耳菌种生长环节添加外源硒肥，测定最终子实体总硒含量，以期优化富硒黑木耳的制备工艺。
硒元素作为价值高的多功能生命营养元素之一，大多重要代谢酶所必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等作用，对人体健康具有重要意义；
在一定范围内低剂量使用可以对人体有益，超过食用范围就会有副作用。在抵抗基体细胞氧化、衰老等方面与锗元素有显著协同效应；
硒元素（Se）在自然界存在方式主要以常见的有机态和无机态两种形式。常见的无机硒 Na2SeO4、亚硒酸 Na2SeO3等。无机硒吸收率低下、转化率低、适口性较差，有一定毒副作用，所以适用范围受限；
源于食用菌子实体的硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸等毒性小，生物利用率高，则成为了人类从食物中获得硒的重要来源。对于食用菌富硒研究方面，以高等食用真菌的耐硒、富硒能力的研究以及富硒多糖、蛋白的活性研究居多。目前已有将黑木耳、金针菇、平菇、香菇和猴头菌等食用菌作为载体培育出富硒子实体。相对黑木耳的研究，大多在食用菌生物量的培养条件方面，对多糖和蛋白的提取也有大量探索。探索制备优化条件，以期为后期利用提供理论研究基础和技术支撑。
1.1 材料与仪器
阿克苏本地木耳栽培实验菌种，硝酸（ρ1.42g/mL），盐酸（ρ1.19g/mL），优级纯。过氧化氢，亚硒酸钠（Sigma-Aldrich，CAS No.：10102-18-8）、硒标准品（5%基体硝酸）。
电热恒温水浴锅（HHS型，上海一恒科技有限公司，中国）；
磁力加热搅拌器（CJJ78-1型，金坛市恒丰仪器制造有限公司，中国）；
雷磁酸度计（pHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司，中国）；
集热式磁力加热搅拌器（DF-Ⅱ型，金坛市恒丰仪器制造有限公司，中国）；
电子天平（JA2603B型，上海精科天美科学仪器有限公司，中国）；
火焰原子吸收光谱仪(普析仪器）。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺方法
杨树（干基）枝粉碎预处理→添加辅料，调适量水→添加亚硒酸钠营养剂水溶液→基质充分混合均匀→最后调水。总含水量60%。调节混合料pH→及时装袋→常压灭菌10h得富硒黑木耳培养料→冷却→接种→菌棒养菌→菌丝满袋→打出耳口→摆棒、排场→出耳管理→采耳→干品检测。
木耳基料配方：杨树木屑70%（预处理）、麸皮12%、豆粉1.5%、花生麸1.5%、糖1.5%、CaCO31.5%，和生石灰1.5%，混合后，经过拌料4次，加入浓度不同硒肥，将硒肥溶于水中混合均匀后，调节pH值为7-9，装袋，常压灭菌，温度为100℃，时间12-16h，冷却即得富硒黑木耳培养料。
1.2.2 总硒的测定
称取黑木耳干粉样品，加7.0mL HNO3放置过夜，再加2.0mL H2O2，微波消解系统进行消化30min，冷却后用少量超纯水溶解，并定容到25.00mL，用火焰原子吸收光度法测定子实体含硒量。
1.3 响应面实验
在前期单因素实验基础上，以富硒木耳制备的无机硒添加量、溶液pH、灭菌温度作为响应子，子实体总硒含量为响应值，进行Box-Behnken的中心组合实验设计，响应面实验设计见表1。
表1 响应面实验因素及编码水平
2.1 响应面法确定制备富硒木耳的最佳工艺
根据 Box-Behnken 的统计设计原理，参考前期单因素实验结果，采用响应面分析法对制备富硒木耳的工艺进行分析和优化，单因素实验结果如表1所示。硒含量浓度（mg/kg），进行回归分析得到关于无机硒添加量、溶液pH、灭菌温度的三个因素的拟合二次项多项式方程：
总硒=110.29+6.97A+4.52B+1.24C-0.99AB-2.47AC-0.16BC-6A2-13.88B2-10.26C2
Design Expert7.0软件分析结果中，模型的p值<0.0001，说明此模型统计学上具有显著性。决定系数（R2）是0.9968，表明约有0.0032左右响应面变异性不能用这个数学模型来解释。调整后的变异系数 R2adj=99.28% 大于预期确定系数95.92%，说明两者有很好的相关性，且失拟项p=0.0805（p>0.05）不显著，回归显著，其与纯误差没有明显相关性，说明模型的建立是合理的，在已知的变量范围内都可以用本模型进行预测。
图1显示了当灭菌温度为中心水平时，硒添加量、溶液pH对子实体总硒含量的交互作用。溶液pH一定时，子实体总硒含量随着硒添加量呈现先增大后减小的趋势；
当硒添加量不变时，子实体总硒含量浓度随着溶液pH也呈现先增大后减小的趋势；
硒添加量100-104ug、溶液pH在7.5-8.5之间时，子实体总硒含量有最大值。
表2 响应面分析方案及实验结果
图1 硒添加量、溶液pH 对子实体总硒含量的响应面图
图2显示了当溶液pH为中心水平时，硒添加量、灭菌温度对子实体总硒含量的交互作用。硒添加量一定时，子实体总硒含量随着灭菌温度呈现先增大后减小的趋势；
当灭菌温度不变时，子实体总硒含量浓度随着硒添加量也呈现先增大后缓慢减小的趋势；
硒添加量100-104ug、灭菌温度在96-102℃之间时，子实体总硒含量有最大值。
图2 硒添加量、灭菌温度对子实体总硒含量的响应面图
表3 响应面模型的方差分析
图3显示了当硒添加量为中心水平时，灭菌温度、溶液pH对子实体总硒含量的交互作用。溶液pH一定时，子实体总硒含量随着灭菌温度呈现先增大后减小的趋势；
当灭菌温度不变时，子实体总硒含量浓度随着溶液pH也呈现先增大后减小的趋势；
硒添加量100-104ug、溶液pH在7.5-8.5之间时，子实体总硒含量有最大值。
图3 灭菌温度、溶液pH 对子实体总硒、含量的响应面图
2.2 验证性实验
由软件自动分析可得到富硒木耳制备工艺最佳理论值：硒添加量102.25ug/g、溶液pH7.89、灭菌温度99.60℃，子实体总硒含量112.601mg/kg。考虑实际操作方便，选取硒添加量102ug/g、溶液pH7.9、灭菌温度100℃，进行3次平行实验，最终子实体浓度为110.1mg/kg，与理论值较为接近，说明该数学模型的建立对富硒木耳制备具有可行性。
通过单因素（添加量、溶液pH、灭菌温度）三水平为实验因素，以子实体总硒含量指标，利用响应面软件对上述指标为响应值进行模型建立和模型预测，得制备富硒木耳最佳提取工艺条件分别为：硒添加量102ug/g、溶液pH7.9、灭菌温度100℃，在此工艺条件下，子实体的总硒含量可达110.1mg/kg，相比理论值减少了2.2%。说明该数学模型对优化木耳子实体提取工艺可行，并为综合利用阿克苏本地资源开展富硒木耳资源提供了理论依据。
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