刘思邈，孙清华，张凤军，马永强，冯志文，张若芳*
（1.内蒙古大学马铃薯工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010021；
2.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016）
马铃薯原产于南美洲安第斯山高山区，由于其块茎具有较高的营养价值，是仅次于水稻和小麦的全球第三大粮食作物[1]。在中国马铃薯种植范围较为广泛，覆盖了东北、华北、西北、西南和华南各地区，种植面积达4.67×106hm2左右。但随之而来的是马铃薯病虫害对其产量的影响日益突出，其中黑胫病为生产上广泛发生的病害之一，发病严重时田间发病率可达50%以上，严重降低了马铃薯的产量和品质，使种植户遭受巨大经济损失。
马铃薯黑胫病是一种细菌性病害，一般是种薯带菌开始腐烂，传至地下茎，地下茎腐烂后传至地上茎基部，维管束病变部位呈现黑褐色，植物叶片开始萎蔫，茎基部撕裂折断；
后期病菌通过匍匐茎传入到新的块茎中，导致新生块茎腐烂。马铃薯黑胫病病原菌属于果胶杆菌属（Pectobacteriumspp.）和狄克氏菌属（Dickeyaspp.），果胶杆菌科（Pectobacteriaceae），变形菌门（Proteobacteria）[2]，其宿主范围广泛，包括马铃薯在内的其他蔬菜作物以及观赏植物[3]。其中果胶杆菌属和狄克氏菌属分布尤为广泛，已报道可以侵染39 个科的86 种不同植物[4]。在中国，马铃薯黑胫病主要致病菌为果胶杆菌属病原菌。该病原菌分布广泛，在不同区域病原群体结构特征可能存在差异。本研究从青海省马铃薯产区病样组织中分离致病菌，通过16S rRNA序列、多位点序列分析以及致病性进行病原菌的鉴定，比较分析不同菌株的致病力，期望了解不同区域的主要病原菌种类，为制定有针对性的黑胫病有效防控措施提供理论基础。
1.1 分离和纯化
2021年9月，在青海省西宁市（E101.74°，N36.56°）马铃薯产区（调查面积为30 hm2）发现疑似黑胫病感染植株（图1），发病率为20%左右。从该产区采集到‘Favorita’疑似病株5 株，分离得到Pectobacteriumspp. 3 株 ， 命 名 为 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224。将样品进行分离病原菌，首先将受黑胫病感染的植物茎部切下，在75%乙醇中浸泡2 min，用蒸馏水冲洗干净，移至磨样袋中，并加入无菌蒸馏水，充分研磨，保留上清液，将上述溶液梯度稀释，接种到结晶紫果胶酸琼脂（Crystal violet pectate，CVP）平板上，28℃孵育2～3 d[5]，用牙签挑取在CVP 平板上出现的单个细菌菌落，并在营养琼脂上划线，以获得纯菌落。
图1 田间马铃薯植株黑胫病症状Figure 1 Symptoms of blackleg on potato plant from the field
1.2 供试菌株DNA提取
将所分离到的细菌置于营养肉汤（Nutrient broth，NB）培养基中，28℃，200 r/min 振荡培养16 h，将细菌悬浮液在12 000 r/min 下离心2 min，使用TaKaRa Mini BEST 细菌基因组DNA 提取试剂盒进行细菌基因组DNA的提取。
1.3 16S rRNA基因序列分析
使用通用引物8F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGA CTT），对待测菌株进行16S rRNA 基因扩增，反应体系为：Green Mix，12.5 μL，引物各 0.6 μL，模板 1.0 μL，ddH2O 10.3 μL，反应程序为：98℃，5 min；
98℃，10 s，退火温度 55℃，5 s，72℃，100 s，29 个循环；
72℃，5 min。PCR 反应使用T100 TM 热循环仪（美国Bio-Rad）完成。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，质量良好的PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger 测序，将获得序列与GenBank 数据库中己知序列进行Blast 比对，并利用MEGAX[6]软件，使用最大似然法和Tamura-Nei model进行16S系统发育树的构建。
1.4 多位点序列分析
采用多位点序列分析，对病原菌proA（MT427753-MT427756）、icdA（MT427761-MT427764）、mdh（MT427765-MT427768）、gapA（MT427769-MT427772）[4]、gyrA（MT427757-MT427760）和rpoS（MT427773-MT427776）[7]6个管家基因进行PCR扩增，反应体系为：Prime STAR HS DNA Polymerase（2×），12.5 μL，引物各0.6 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.3 μL，反应程序为：98℃，5 min；
98℃，10 s，退火温度59℃，5 s，72℃，1 min，29 个循环；
72℃，5 min。PCR反应使用T100 TM 热循环仪（美国Bio-Rad）完成。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，质量良好的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序，将获得序列与GenBank数据库中己知序列进行Blast 比对，并利用MEGAX[6]软件，使用最大似然法和Tamura-Nei model 进行MLSA 系统发育树的构建。
1.5 致病性检测
1.5.1 植株检测
3株分离株菌悬液（106cfu/mL）以茎基部注射方式侵染马铃薯品种‘费乌瑞它’的幼苗（每株菌侵染5 株植株），以无菌水或营养肉汤（NB）培养基作为对照，幼苗生长环境保持在相对湿度80%、温度21℃，侵染7 d后拍照记录[8]。
1.5.2 薯块检测
选用‘Favorita’种薯，切成两半，3株P.polaris菌株菌悬液（106cfu/mL）离心，弃上清液，沉淀加入无菌蒸馏水中制成混悬液，于马铃薯切面的四角及中间部位穿刺并注入100 μL 混悬液，以无菌水为对照，3 次重复[9]。接种后处理与对照分别包裹封口膜，以保持薯块湿度，于28℃培养2～3 d，观察发病情况。
2.1 16S rRNA基因序列分析
基于16S rRNA基因完整序列，以Dickeyaspp.菌株，以及Erwiniaspp.菌株为外群，将ZRIMU1222、ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌株序列（登录号分别为：OP389242、OP389243 和 OP389244）与已发表的18 株果胶杆菌菌株的序列构建系统发育树。结果显示，本研究分离得到的3个菌株与P.polaris菌株构成了明显的分枝，已发表的P. atrosepticum、P. brasiliense、P. carotovorum与P. parmentieri株系形成的类群则分别构成了独立的分枝（图2）。
图2 基于3株分离株及其他果胶杆菌属菌株16S rRNA基因序列的系统进化树Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of three strains and other Pectobacterium strains
2.2 多位点序列分析
基于菌株的多位点rpoS-proA-gapA-icdA-gyrA-mdh碱基串联序列，用Pectobacteriumspp.及其密切相关的物种Dickeyaspp.的菌株构建系统发育树（图3）。结果显示，分离株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224亲缘关系较近，与Pectobacterium polaris其他菌株聚集到一起，同属一个分枝；
与其他Pectobacteriumspp.，Dickeyaspp.以及Erwiniaspp.亲缘关系较远。由此，可以推断出分离株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224这3株菌株具有较高的相似性，且均来源于果胶杆菌属，属于Pectobacterium polaris。
图3 基于3株分离株及其他果胶杆菌属菌株rpoS、proA、gapA、icdA、gyrA和mdh多位点序列的系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree based on the multi-locus sequence of rpoS,proA,gapA,icdA,gyrA,and mdh of three strains and other Pectobacterium strains
2.3 致病性检测
用 106cfu/mL 的 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌液和营养肉汤（NB）培养基（对照）注入马铃薯品种‘费乌瑞它’的幼苗，结果显示注射ZRIMU1222、ZRIMU1223 和 ZRIMU1224 菌液的幼苗均出现症状（茎基部腐烂发黑），而对照植株无病症，注射伤口呈愈合状态（图4）。薯块侵染3 d后，感染Pectobacterium的薯块均表现出溃烂发臭的症状（图4），对照组无病症，薯肉紧实无溃烂症状。
图4 基于科赫法则将分离株分别感染‘费乌瑞它’幼苗和块茎Figure 4 "Favorita"seedlings and tubers infected with candidate pathogenic isolates for Koch"s postulate test
马铃薯黑胫病是一种细菌性病害，在中国马铃薯产区发生严重，可发生在马铃薯生长发育的各个阶段，通过影响出苗率、幼苗存活率降低产量，造成经济损失[10]。由于马铃薯新品种的更新、检疫制度不健全及种薯跨区调运频繁，使得马铃薯黑胫病发生呈逐年上升趋势[11]，新的致病菌逐步走入大众的视野，Pectobacteriumspp.属的种和亚种数量逐渐增加。在症状上，几种致病菌引起的黑胫和软腐症状是类似的，所以单单依靠表型特征和生理生化测试进行相同种或亚种之间的准确鉴别变得比较困难。DNA标记、血清学[12]、16S rRNA序列[13]以及多位点序列分析[14]，在许多植物病原细菌致病亚种和致病型区分方面有较多报道，是目前较常用的细菌系统发育分类方法。本研究运用生物信息学，通过对同源序列进行筛选、序列比对、进化树构建、评估进化树4个步骤，对其基因组进行分析，所得实验结果均表明，分离的3 个Pectobacterium polaris菌株与已发表的Pectobacterium polaris株系共同形成了明显的Pectobacterium polaris分枝，且该分枝与其他种（或亚种）形成了不同类群，由此可以推断这3 株分离物属于Pectobacterium polaris菌株。后续致病性检测表明，3株分离株均满足科赫法则，且被侵染的植株维管束病变部位均呈现黑褐色，被侵染的薯块溃烂发臭。
目前，青海地区已检测并报道的病原菌为Pectobacterium atrosepticum[15]，而Pectobacterium polaris病原菌株尚未报道。近几年，欧洲国家，如波兰[16]、俄罗斯[17]、土耳其[18]等对于Pectobacterium polaris均有报道。在中国，Wang 等[19]在河北，首次发现并报道了Pectobacterium polaris菌株，Handique等[20]在内蒙古自治区及四川省相继报道了该菌株。本研究发现的3株病原菌Pectobacterium polaris在青海省为首次报道，期望此研究为后续致病机理的研究以及生防菌的开发奠定基础。
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