李瑞星 马丙祥 孔亚敏 张雪原 陈慧敏
（河南中医药大学儿科医学院，河南 郑州 450056）
宫内窘迫或出生窒息所造成的缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是造成新生儿脑损伤的主要原因[1]。重度窒息所致的足月儿缺血缺氧性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）也是新生儿死亡或致残的主要病因之一[2]。研究缺氧缺血性脑损伤的发生机制，早期干预、治疗，对防治新生儿神经损伤和减少远期伤残具有重要意义。
中医理论认为“痰”和“瘀”是HIBD 发病的重要病理因素，“痰瘀阻窍，经络不通”是其主要病理机制。根据HIBD 的痰瘀发病理论，研究团队创制了蒲金口服液（石菖蒲、郁金、丹参、红花），取得了良好的临床治疗效果。本研究拟应用透射电子显观察微镜观察突触超微结构、测量突触后致密物厚度以蒲金口服液对HIBD 幼鼠突触后膜可塑性的影响，探讨其对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用机制。
1.1 材料 选取7 日龄SPF 级健康SD 幼年大鼠112只，雄性，体质量（25±5）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）20190003。实验在河南省中医药研究院实验中心进行。实验所用幼鼠随母鼠分笼喂养，室温20～25 ℃，明暗节律12 h/12 h，母乳喂养。
1.2 模型制备与分组 手术组动物经1%戊巴比妥钠溶液美国（Sigma 公司，货号：P3761-5）腹腔注射麻醉后，分离左侧颈总动脉，双重结扎后剪断血管。术后置于含92% N2和8% O2混合气体的缺氧舱内，持续缺氧2 h。手术当天记为第0 天。手术组动物复苏后，进行行为学评定，以身体向一侧旋转、右侧肢体活动不利、翻身不利、行走不稳、不能走直线为造模成功。手术组造模成功幼鼠随机分为中药组、西药组、模型组。假手术组只分离左侧颈总动脉但不结扎，缝合皮肤后不做缺氧处理。空白组不做任何处理。中药组予蒲金口服液0.1 mL/（kg·d）灌胃，每日1 次；
西药组予单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液（齐鲁制药有限公司，国药准字H20046213）3 mL/（kg·d）腹腔注射，每日1 次；
余组予生理盐水0.1 mL/（kg·d）灌胃，每日1次。各组均连续干预14 d。
1.3 学习与记忆行为测试 于制模后，幼鼠17 日龄开始进行定位航行训练，于21 日龄干预疗程结束后，各组分别取6 只动物进行Morris 水迷宫定位航行实验及空间探索实验，观察记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及隐匿平台逃避潜伏期（Escape 1atency period，Elp）和穿台次数，以测试幼鼠学习记忆的获取能力和记忆保持能力。
1.4 尼氏染色标本制备 各组动物在水迷宫测试结束后（21 d）行灌注固定（6 只），取脑制作石蜡切片。采用焦油紫法，用尼氏染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，型号：G1430）进行染色，400 倍镜下每张切片取3个视野进行尼氏体计数。
1.5 透射电子显微镜标本制备 每组取2 只幼鼠，麻醉后行心脏灌注取脑，切取1 mm3大小海马组织，放入2.5%戊二醛固定液中，送至河南中医药大学电镜中心处理。20000 倍视野下，每个标本任意取3 个视野，计数突触数目。50000 倍视野下，每个标本取3 个突触测量突触后致密物的平均厚度：利用图像分析仪，测量正方测试格的测试线与突触后致密物相交所截得截线的截距，并计算其平均值，代入公式：τ=l/2，其中τ：突触后致密物的平均厚度；
l：测试线与突触后致密物相交所得截线的平均截距。
1.6 Western Blot 检测脑组织PSD-95、NMDAR-2B的表达 在水迷宫测试结束后（21 d）每组取6 只幼鼠断头取脑，剥离海马组织行蛋白免疫印迹（Western Blotting，WB）检测。突触后密度蛋白95（PSD-95）、谷氨酸受体2B 抗体（NMDAR-2B）购买自Abcam 公司。其余辅助试剂购买自武汉博士德生物工程有限公司。
1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行统计。实验数据以（）表示，两样本均数比较采用t 检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 水迷宫实验结果 与模型组比较，其余各组隐匿平台逃避潜伏期缩短（P ＜0.05）。与空白组和假手术组比较，其余各组穿台次数下降（P ＜0.05）；
中药组、西药组和模型组之间穿台次数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。
表1 各组幼鼠Morris 水迷宫实验结果（）
表1 各组幼鼠Morris 水迷宫实验结果（）
注：与其余各组相比，1）P<0.05；
与假手术组和空白组比较，2）P<0.05，与空白组比较，3）P<0.05。
2.2 脑组织尼氏染色结果 尼氏染色结果显示，模型组幼鼠结扎侧脑组织神经元数目缺失，核固缩，淡染；
空白组及假手术组幼鼠同侧脑组织神经元表达正常，呈紫蓝色，形态正常。中药组和西药组幼鼠结扎侧脑组织神经元表达情况较模型组有所改善。见图1、表2。
表2 各组幼鼠脑组织尼氏小体计数结果（，个）
表2 各组幼鼠脑组织尼氏小体计数结果（，个）
注：与其余各组相比，1）P<0.05。
2.3 透射电镜分析结果 透射电镜下，观察脑组织突触超微结构，可见：模型组突触数目减少，突触小泡不丰富，突触内线粒体数量偏少，结构不清，突触前膜不清晰，突触后膜变薄，突触间隙增宽；
中药组以上情况改善明显，西药组有所改善。见图2、图3 和表3。
图2 术后第14 天各组幼鼠脑组织电镜（×20000）
图3 术后第14 天各组幼鼠脑组织电镜（×50000）
表3 各组幼鼠电镜下突触计数及突触后致密物厚度测定结果（）
表3 各组幼鼠电镜下突触计数及突触后致密物厚度测定结果（）
注：与其余各组相比，1）P<0.05
2.4 WB 检测脑组织海马区PSD-95、NMDAR-2B 蛋白表达结果 WB 检测显示模型组幼鼠患侧脑组织海马区PSD-95、NMDAR-2B 表达减少（P ＜0.05）。中药组和西药组PSD-95、NMDAR-2B 表达较模型组增多（P ＜0.05），与假手术组和空白组差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。
表4 各组幼鼠脑组织PSD-95、NMDAR-2B 蛋白定量结果（）
表4 各组幼鼠脑组织PSD-95、NMDAR-2B 蛋白定量结果（）
注：与假手术组、空白组比较，1）P＞0.05；
与其余各组比较，2）P＜0.05。
HIBD 是儿童死亡及神经损害的重要原因，特别是新生儿时期HIBD 常导致长久性神经功能障碍，出现神经残疾性疾病、神经发育障碍性疾病等。发育期脑组织缺氧缺血条件下，约25%患儿会遗留严重的神经心理后遗症，如脑性瘫痪、癫痫、智力发育障碍、精神行为障碍等，严重影响HIBD 幸存者的生活质量[3]。据估计，发达国家足月新生儿HIBD 发生率为2‰～4‰，发展中国家是其20～30 倍，早产儿发生率更高[4]。
缺氧缺血致使突触囊泡、突触后致密物及突触黏附分子失常，突触发育障碍，是HIBD 远期神经功能异常，出现行为、认知障碍的重要原因[5]。突触功能稳定性是神经冲动传导的前提，因此，如何恢复突触稳态是HIBD 后神经修复与再生的研究热点。突触可塑性是指突触在一定条件下调整功能、改变形态、增加或减少突触数目的能力，既包括形态结构的变化，如突触后致密物质（PSD）增厚或变薄等，也包括传递效能的变化，神经突触可塑性被认为是学习和记忆的发生机制[6]。谷氨酸受体是中枢神经系统中极为重要的兴奋性神经递质受体，在中枢神经系统中突触前膜释放的谷氨酸主要与突触后膜的2 种离子型谷氨酸受体结合从而发挥功能活性，即N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）和α-氨基-3 羟基-5 甲基-4 异恶唑受体（AMPAR）[7]。NMDAR 与神经递质结合后，信号蛋白受到刺激激活其下游信号通路，完成NMDAR 对突触可塑性的调节[8]。另外，PSD-95 既是位于突触后膜的结构蛋白，又是离子通道与下游效应器衔接的衔接蛋白，通过串集、锚定的作用介导神经冲动信号的传导，使NMDAR 族集在突触的活性区，保证NMDA 受体集中在特定区域，使兴奋性突触信号能够有效传递，从而参与受体和信号蛋白的突触前膜的定位、哺乳动物神经系统的发育以及突触的可塑性与稳定性，与神经系统多种生理及病理活动具有密切关系[7，9-12]。
新生儿缺氧缺血性脑损伤在中医学中无专有病名，据其临床症状，可归属于中医学“五硬”“痿证”“五软”“五迟”等范畴。经过长期的临床实践，结合中医整体观念、辨证论治等理论，本研究团队提出“痰”和“瘀”是HIBD 重要病理因素，“痰瘀阻窍，经络不通”是其主要发病机制，提出对HIBD 的治疗要注重活血化瘀、通经开窍，创制了蒲金口服液，取得了良好的临床疗效。蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹参、红花组成，具有化痰开窍、活瘀通络之效。前期相关的实验研究结果显示，蒲金口服液能够减少一氧化氮合酶（NOS）合成、减轻一氧化氮（NO）造成的脑损伤，还能提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制脂质过氧化反应；
蒲金口服液治疗后，脑瘫模型动物脑室周围白质软化情况有所改善，脑组织病理损害减轻[13]。本实验研究结果显示，HIBD 幼鼠脑组织神经元数目下降，海马区突触超微结构被破坏，经蒲金口服液干预后，其学习记忆能力较模型组有明显改善（P ＜0.05）。药物干预组幼鼠脑组织中PSD-95、NMDAR-2B 表达较模型组增强（P ＜0.05）。因此，蒲金口服液对HIBD 幼鼠的治疗效果可能与减少神经元凋亡和增强PSD-95、NMDAR-2B 的表达，维护神经突触稳态有关，提示蒲金口服液可能通过促进神经突触的修复达到治疗目的。
本文来源：http://www.triumph-cn.com/fanwendaquan/gongwenfanwen/2023/0726/92011.html