张鹏飞，潘 玲，张华玲，廖丽君，郭栋伟，何智群
(1. 柳州市中医医院(柳州市壮医医院)，广西 柳州 545000；
2. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530000)
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续性的呼吸道症状与不完全可逆的气流受限为特征的常见呼吸系统疾病，其发病与长期暴露于有害气体或有毒颗粒密切相关[1]。在我国20岁及以上人群中COPD的患病率为8.6%，而40岁以上人群中，COPD患病率高达13.7%，COPD已成为重要的公共卫生问题，给患者及其家庭以及社会带来沉重的经济负担[2]。慢性的肺部与气道炎症引起的肺结构性变化、小气道狭窄和肺实质破坏是导致COPD进展的核心机制[3]。研究证实磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路可通过调控炎症介质释放、炎症细胞活化、气道重构，在COPD的发生、发展过程中发挥重要作用[4]。因此，通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制炎症因子的释放，减轻气道炎症与全身炎症反应，抑制气道重塑可能成为治疗COPD的新途径。课题组前期研究发现银杏叶提取物能减轻COPD大鼠支气管和小动脉周围的炎症反应，降低大鼠肺组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，从而发挥抑制气道重塑和小动脉重塑的作用，并能延缓COPD大鼠肺间质纤维化的进展[5-6]，但其具体作用机制尚不明确。本实验旨在通过研究银杏叶提取物对PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控作用，探讨其治疗COPD的可能机制，为银杏叶提取物在COPD中的应用提供更多实验依据。
1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠90只，体重(200±20)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(湘)2019-0013。实验前1周将Wistar大鼠置于实验环境中饲养，室温25～28 ℃，空气流通好，颗粒麦麸喂养。饲养笼具、饲料、饮水均按SPF级实验动物的要求进行制备、消毒。本实验经广西中医药大学实验动物福利伦理委员会批准(DW20220615-063)
1.2主要药物 银杏叶提取物选用舒血宁注射液，河北神威药业集团有限公司(国药准字Z13020795，规格：5 mL×1支，折合银杏叶提取物17.5 mg，含总黄酮醇苷4.2 mg、银杏内酯0.70 mg)；
康士得，爱必信(上海)生物科技有限公司(货号：ABS817935)；
雷帕霉素，大连美仑生物技术有限公司(货号：MB1197)；
Taselisib，美国MCE公司(货号：HY-13898)。
1.3主要试剂与仪器 云烟过滤嘴香烟，红云红河烟草有限责任公司(焦油量10 mg、烟气烟碱量1.1 mg、烟气一氧化碳含量12 mg)；
脂多糖(LPS)，美国Sigma公司(货号：L2880)；
白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒(生产批号：R210413-004b)、γ-干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒(生产批号：R201127-101a)，深圳市欣博盛生物科技有限公司；
PI3Kp110α(货号：4249)、Akt(货号：4691)、p-Akt(货号：4060)、mTOR(货号：2983)、p-mTOR(货号：5536)、LC3A/B(货号：12741)均购自美国CST公司；
SYBR FAST qPCR Master Mix(货号：KM4101)购自美国KAPA公司。生物组织石蜡包埋机(YB-6LF，湖北孝感亚光)，石蜡切片机(RM2235，德国LAICA)，倒置显微镜(MI52-N，广东明美)，超低温冰箱(705，美国THERMO)，酶联免疫检测仪(DG5033A，南京华东)，全自动化学发光分析仪(Tanon-5200，上海天能)，PCR原位杂交仪(S1000，美国BIO-RAD)，实时荧光定量PCR仪(7500，美国ABI)。
1.4分组、造模及干预方法 将大鼠随机分为正常组、模型组、银杏叶提取物组、康士得组、雷帕霉素组、Taselisib组，每组15只。除正常组外，其余各组大鼠参考文献[7]，采用香烟烟雾熏吸联合气管内注入LPS方法构建COPD模型：在造模的第1天、第14天将大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于操作台，暴露喉头，向大鼠气管内注入LPS 100 μL/100 g(1 mg/mL)，完毕后将大鼠直立旋转10～20 s，使LPS均匀分布于肺部，于实验的第2～13天、第15～28天，每天在自制烟熏箱(120 cm×80 cm×80 cm，含1个进烟孔和2个排烟孔)中对大鼠进行香烟烟雾暴露，持续吸入香烟烟雾1 h/d，30支/d，造模28 d结束；
正常组于实验第1天、第14天气管内注入生理盐水(100 μL/100 g)，其余时间均进行正常饲养。造模结束后从每组大鼠中各随机选取2只行肺功能检测，检测结束后处死大鼠进行肺组织病理检测，确定COPD建立是否成功[8]。造模过程中，因麻醉意外和香烟烟雾熏吸致使正常组、银杏叶提取物组、康士得组、雷帕霉素组各死亡1只大鼠，模型组和Taselisib组各死亡2只大鼠。于实验的第15～28天，银杏叶提取物组给予舒血宁注射液0.4 mL/(kg·d)腹腔注射，其余组均给予生理盐水腹腔注射；
于实验第29～42天，采用由二甲基亚砜、聚乙二醇、吐温80、生理盐水配制的混合溶剂溶解康士得、雷帕霉素与Taselisib，康士得组按照1.0 mg/(kg·d)、雷帕霉素组按照0.5 mg/(kg·d)、Taselisib组按照1.5 mg/(kg·d)腹腔注射给药，正常组、模型组、银杏叶提取物组均腹腔注射混合溶剂。
1.5标本采集 实验的第43天，将各组大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，每只腹主动脉采血5 mL，于3 000 r/min离心15 min，留取血清分装，置于-80 ℃冰箱保存待检；
剪开大鼠颈部皮肤，分离气管，在环状软骨下用剪刀做T字形切口，将自制气管插管由切口插入气管内，用缝线结扎固定，取5 mL注射器去针头吸取生理盐水3 mL，从气管套管口注入肺脏，轻柔按摩2 min后回吸，重复3次，回收肺泡灌洗液约6 mL，3 000 r/min离心15 min后取上清置于-80 ℃冰箱保存待检；
随后剖取肺脏，取距离肺门3 mm处的右肺组织做连续切片用于病理检测、免疫组化，采用多聚甲醛固定液固定肺组织；
余右肺组织置于-80 ℃冰箱保存用于后续蛋白提取与RNA提取。
1.6观察指标与方法
1.6.1肺组织病理形态 将大鼠右肺组织置于4%多聚甲醛中固定48 h，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，冰冻后切片，切片厚度为3 μm，二甲苯脱蜡脱水，行HE染色后镜下观察。
1.6.2炎症因子水平 采用ELISA检测各组大鼠血清与肺泡灌洗液中 IL-10、IFN-γ水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.6.3肺组织中LC3蛋白表达情况 采用免疫组织化学LC3染色法观察：冰冻切片后，将玻片置于65 ℃恒温烘箱中烤片1 h，置于二甲苯中浸泡脱蜡，予梯度酒精水化，采用1 mmol/L Tris-EDTA 缓冲溶液中高压(125 ℃、103 kPa)进行抗原修复，将玻片置于3%H2O2中，湿盒孵育10 min进行过氧化物酶阻断，玻片置于10%山羊血清中进行封闭，稀释一抗浓度为 LC3B(1∶200)，添加一抗LC3A/B，4 ℃孵育过夜，PBS清洗后滴加 maxvision二抗，湿盒孵育，37 ℃孵育60 min，然后予DAB显色、流水冲洗玻片、苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片等处理后，显微镜下观察各组LC3蛋白表达情况。
1.6.4肺组织中PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3Ⅱ蛋白表达情况 采用Western blot法检测：将各组大鼠肺组织剪成细小的碎片，按每20 mg组织加入200 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4 ℃下12 000×g离心15 min，取上清，提取肺组织的总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白浓度使各组保持一致，取20 μg总蛋白上样，用SDS-PAGE电泳分离后，湿法转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后加入一抗PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3A/B、β-Actin，稀释比均为1∶1 000，4 ℃过夜，PBST 洗涤3次，按照 1∶10 000稀释 HRP标记的羊抗兔IgG二抗，与膜室温孵育1 h，用PBST洗涤3次，将膜放置在暗室中，根据用量取ECL发光液进行显影，采用Image J图像分析软件统计各条带灰度值并计算各蛋白表达量。
1.6.5肺组织中PI3K、Akt、mTOR、Beclin1 mRNA表达情况 采用实时荧光定量PCR法检测：按照Trizol试剂说明书提取肺组织总RNA，反转录合成cDNA作为模板，将制备好的cDNA进行 PCR扩增，采用2-ΔΔCt法分析各组PI3K、Akt、mTOR、Beclin1 mRNA相对表达量。引物信息见表1。
表1 PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、GAPDH的引物序列
2.1各组大鼠肺泡病理形态 正常组大鼠肺泡结构正常，肺泡壁完整，肺泡腔无扩大，肺泡周围无炎性细胞浸润；
模型组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡腔扩大，大量肺泡壁断裂融合形成较多肺大泡，肺泡周围炎性细胞浸润明显；
银杏叶提取物组与各抑制剂组大鼠肺泡结构稍紊乱，肺泡腔略扩大，部分肺泡壁断裂融合形成少量肺大泡，肺泡周围可见少量炎性细胞浸润。见图1。
图1 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺泡病理表现(HE，×200)
2.2各组大鼠气道病理形态 正常组大鼠支气管
结构正常，管腔通畅、无狭窄，管壁无增厚，纤毛排列整齐，且无倒伏、脱落现象，管腔周围未见炎症性细胞浸润；
模型组大鼠支气管结构破坏明显，管腔阻塞严重，管壁明显增厚，纤毛排列紊乱、倒伏、脱落明显，管壁及其周围可见大量炎性细胞浸润伴结缔组织增生；
与模型组相比，银杏叶提取物组及各抑制剂组大鼠支气管结构破坏、管腔狭窄及管壁增厚程度均有一定程度改善，纤毛排列相对整齐，部分纤毛倒伏、脱落，管腔周围可见少量炎症性细胞浸润。见图2。
图2 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠气道病理表现(HE，× 400)
2.3各组大鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10、IFN-γ水平比较 与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10水平均明显降低(P均<0.05)，IFN-γ水平均明显增高(P均<0.05)；
与模型组比较，银杏叶提取物组与各抑制剂组大鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10水平均明显增高(P均<0.05)，IFN-γ水平均明显降低(P均<0.05)；
各药物组中，康士得组肺泡灌洗液中IL-10和IFN-γ水平均最低(P均<0.05)，雷帕霉素组和Taselisib 组血清中IL-10水平明显高于银杏叶提取物组(P均<0.05)，雷帕霉素组血清中IFN-γ水平明显低于银杏叶提取物组(P<0.05)。见表2。
表2 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10、IFN-γ水平比较
2.4各组大鼠肺组织中LC3蛋白表达情况 苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出阳性为棕黄色，主要定位于细胞浆中。模型组LC3蛋白表达明显增强，光密度值为0.11±0.01，明显高于正常组的0.06±0.01(P<0.05)；
银杏叶提取物组与各抑制剂组LC3蛋白表达显著增强，光密度值(0.14±0.02，0.15±0.03， 0.15±0.03，0.14±0.02)均明显高于模型组(P均<0.05)，银杏叶提取物组与各抑制剂组组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。
图3 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中LC3蛋白表达情况(免疫组化)
2.5各组大鼠肺组织中PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3Ⅱ蛋白表达情况 与正常组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表达量均明显增加(P<0.05)；
与模型组比较，银杏叶提取物组与各抑制剂组大鼠肺组织中PI3K p110α、Akt、p-Ak、mTOR、p-mTOR蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表达量均明显增加(P均<0.05)；
雷帕霉素组mTOR蛋白表达量明显低于银杏叶提取物组(P<0.05)，其余指标各药物组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4及表3。
图4 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中自噬相关蛋白表达情况
表3 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中自噬相关蛋白表达量比较
2.6各组大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR、Beclin1 mRNA表达情况 与正常组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达量均明显降低(P均<0.05)，Beclin1 mRNA表达量明显升高(P<0.05)；
与模型组比较，银杏叶提取物组与各抑制剂组大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达量均明显降低(P均<0.05)，Beclin1 mRNA表达量均明显升高(P均<0.05)；
各药物组中，Taselisib 组PI3K mRNA表达量、康士得组Akt mRNA表达量、雷帕霉素组mTOR mRNA表达量均明显低于其他组(P均<0.05)，其余指标各药物组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05) 。见表4。
表4 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR、Beclin1 mRNA表达量比较
COPD属于中医“肺胀”“喘证”的范畴，临床主要表现为咳、痰、喘三大症状，本病主因久病咳嗽致使正气虚损、肺气亏虚、卫外功能减弱，易被外邪入侵而诱发。肺气虚证是COPD稳定期最常见的证型，它直接影响COPD的发生发展，并贯穿于COPD的整个疾病过程[9]，因而补益肺气是治疗本病的关键点。银杏为银杏科植物，属于世界上著名的孑遗植物，其叶、种仁和外种皮均含药用成分，被称为“全身都是宝的活化石”。《本草纲目》记载银杏“性味甘苦、涩、平”，“归肺经”，其能清肺益气、止咳、滋阴理气。银杏叶为银杏的干燥叶，性味苦、涩，平，归心、肺经，具有活血化瘀、敛肺平喘之功，主要用于治疗肺虚咳喘、胸痹心痛等[10]。银杏叶提取物是从银杏的干燥叶中提取而来的，由多种活性物质和化学成分构成的混合物，其化学成分十分复杂，主要包括类黄酮、内酯、多酚、烷基酚酸、有机酸、甾体和微量元素等[11]。近年来有关银杏叶提取物治疗COPD的研究日益增多，且其具有针对COPD发病机制的多靶点综合治疗效果，临床应用前景十分广阔[12]。
COPD是一种主要由吸入有毒颗粒物和吸烟引起的，以进行性肺功能障碍为特点的慢性呼吸系统疾病，而长期暴露于有害分子可导致异常炎症反应、呼吸系统永久性损伤和不可逆转的病理变化[13]。COPD的发病机制较为复杂，多种机制共存并相互影响，至今尚未完全清楚，传统观点认为炎症、氧化应激和蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的主要发病机制[14]。近年来随着研究的不断深入，研究者发现自噬在COPD的进展过程中发挥重要作用，并与氧化应激、炎症损伤及气道重塑关系密切[15-16]。自噬是一种通过溶酶体溶解细胞内受损的蛋白质、细胞器、微生物(病毒、细菌、真菌)等来维持细胞内稳态和细胞功能的一种重要的分解代谢过程[17]，PI3K/AKT/mTOR信号通路在自噬中起着关键的调节作用[18]。PI3K作为受体酪氨酸激酶和G蛋白耦联受体的主要下游效应物，可将来自于多种生长因子和细胞因子的信号传导入细胞膜内，并激活其下游效应器Akt[19]，Akt被PI3K磷酸化和激活后，p-Akt进一步激活下游mTOR并使其磷酸化[20]。LC3是哺乳动物自噬诱导最重要、最可靠的指标，当诱导自噬时，LC3可以从细胞质转移到自噬体膜，并从LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ[21]，LC3Ⅱ是代表自噬作用的标志性指标，其表达量的高低与自噬体的数量和自噬的程度呈正相关[22]。Beclin1是调节自噬的另一关键因子，可通过调节PI3K信号传导诱导自噬进而促进自噬体的形成，能在一定程度上反映自噬的水平[23]。IL-10是一种内源性抑炎因子，能够抑制炎症因子IL-17的分泌，血清中IL-10水平与COPD患者年龄、病程长短、疾病严重程度分级呈负相关，是一种COPD保护因子，对COPD的炎症发展具有抑制作用[24]。IFN-γ 属于细胞调节性多肽，可调节炎症因子和炎症介质，在炎症反应中发挥重要作用[25]。研究表明，IFN-γ与COPD气道炎症的发生、发展密切相关，IFN-γ 能够使中性粒细胞被激活，促进其释放炎症介质，进而引起气道炎症，促进其呼吸爆发，最终导致COPD急性加重[26]。
吸烟是COPD的主要危险因素，长期的香烟烟雾暴露可诱导氧化应激和炎症反应，进而引起细胞自噬功能受损，是导致肺老化和COPD肺气肿的重要机制[27]。自噬不足不能通过溶酶体完全去除老化或缺陷的线粒体、错误折叠或受损的蛋白聚集体、自噬体，进而破坏细胞清除过程，加速COPD的发生和进展[28]。於海洋等[29]研究发现，COPD患者肺组织中Beclin1 mRNA与Beclin1、LC3B蛋白的表达明显高于非COPD患者，而重度COPD患者肺组织中Beclin1 mRNA与Beclin1、LC3B蛋白明显低于轻中度COPD患者。曹明嫄等[30]研究发现，通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能够诱导细胞自噬，降低COPD小鼠血清炎症因子水平与肺泡灌洗液中炎性细胞数量，进而抑制气道重塑。Bodas等[31]研究发现，在香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中，自噬活性不足会引起气道炎症加重，通过提高自噬水平可减轻气道炎症。由此可见，当COPD发生时，PI3K/Akt/mTOR信号通路被抑制，自噬被激活，但存在自噬活性不足、自噬功能受损，通过给予PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂可提高自噬活性和自噬水平，维持细胞的正常自噬功能，进而减轻气道炎症，抑制气道重塑。
本研究中采用香烟烟雾熏吸联合气管内注入LPS方法建立COPD大鼠模型。结果与正常组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达量均明显降低，LC3Ⅱ蛋白与Beclin1 mRNA表达量均明显升高，说明COPD发生后，PI3K/Akt/mTOR信号通路被抑制，自噬被激活；
与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液与血清中IL-10水平明显降低，IFN-γ 水平明显升高，肺泡结构紊乱，气道重塑明显，说明COPD大鼠存在自噬功能受损、自噬活性不足，不能有效溶解细胞内受损的蛋白质、细胞器、微生物等，致使机体免疫细胞功能受损，导致气道与全身炎症反应，并进一步引起肺损伤、气道重塑。与模型组比较，银杏叶提取物组和各抑制剂组大鼠肺泡灌洗液与血清中IL-10水平和肺组织中LC3Ⅱ蛋白与Beclin1 mRNA表达量均明显升高，肺泡灌洗液与血清中IFN-γ水平和肺组织中PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达量均明显降低，肺泡结构紊乱、气道重塑情况均有所改善，说明给予银杏叶提取物和各通路抑制剂干预后PI3K/Akt /mTOR信号通路被明显抑制，自噬被进一步激活，自噬活性增强，细胞自噬功能受损情况得到改善，进而减轻气道与全身炎症反应，抑制肺损伤，改善气道重塑。
综上所述，银杏叶提取物能减轻COPD大鼠气道炎症与全身炎症反应，抑制肺泡破坏，改善气道重塑，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路、激活自噬、增强自噬活性、改善自噬功能受损有关，为银杏叶提取物治疗COPD提供了一定实验依据。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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