李元亮，贺安文，刘言言，徐耀辉，唐光武，陈 益，蒋增海
(河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)
猪链球菌(Streptococcussuis,SS)是养猪业中最重要的病原菌之一，可引起猪败血症、脑膜炎、关节炎、流产及突然死亡等，它也是一种重要的人畜共患病原体，可导致人类发生败血症，甚至可能伴有败血性休克、脑膜炎等[1]。根据荚膜抗原分类的不同，可将猪链球菌分为35个血清型(1～34型和1/2型)，其中1型、1/2型、2型、7型、9型和14型均可感染人，以2型致病性最强[2]。最新研究认为，猪链球菌只包含29个血清型(1～19型、21型、23～25型、27～31型、1/2型)[3]，其中血清1型、1/2型、2型、7型、9型、14型及血清8型对猪致病性最强[4，5]。
近年来，全国各地猪链球病的报道较多[6-10]，但关于致脑膜炎猪链球菌病的报道较少[11，12]。2020年10月底，河南省豫西某规模化猪场，60日龄阶段保育仔猪发生零星猝死，有的病猪濒死前表现为颤抖、运动失调、倒地后四肢划水状，疑似脑膜炎型链球菌病。本研究无菌采集发病仔猪的脑部组织，进行病原菌的分离鉴定及药敏试验，旨在为脑膜炎型猪链球菌病的防控与治疗提供参考依据。
1.1 病料来源
2020年10月，采集河南省豫西某规模化猪场发病保育猪的脑部组织。
1.2 主要试剂
脑心浸液肉汤购自英国OXOID公司；
5%鲜血琼脂平板购自江门市凯林贸易有限公司；
2XPCR Taq MasterMix(dye)购自加拿大ABM公司；
DL2,000 DNA Marker由TaKaRa公司提供；
核酸染料由天恩泽公司提供；
药敏片购自北京天坛药物生物技术开发公司；
快速革兰染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。
1.3 仪器与设备
PCR扩增仪(ETC811，北京东胜生物科技公司)；
气浴恒温振荡器(SHZ-82，金坛市杰瑞尔电器有限公司)；
电热恒温培养箱(HP-9272，上海百典仪器设备有限公司)；
立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KB，上海申安医疗器械厂)；
超净工作台(W-CJ-1FD，苏州安泰净化设备有限公司)；
电泳仪(DYY-10C，北京市六一仪器厂)；
凝胶成像分析系统(Gel DocTMXR，美国 BIO-RAD 公司)；
高速离心机(5424R，德国Eppendorf公司)。
1.4 细菌的分离培养
无菌采集病变仔猪的脑部组织，直接涂片进行瑞氏染色、镜检，接种环灭菌后再次挑取脑部组织，接种于血琼脂平板，37 ℃培养24 h。挑取生长大小均匀一致的单菌落接种于血琼脂平板，37 ℃培养24 h，进一步传代纯化，挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，观察细菌的形态特征。
1.5 细菌的PCR鉴定
挑取分离纯化的单菌落，接种于脑心浸液肉汤中，37 ℃过夜培养，然后水煮法提取分离菌株DNA,以此DNA作为扩增模板，针对猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因gdh，按照参考文献[13]设计合成特异性引物(P1:5′-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3′，P2:5′-CCATGGACAGATAAAGATGG-3′，预期扩增片段大小为689 bp)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
通过PCR扩增对分离菌株进行鉴定。反应体系：2XPCR Taq MasterMix(dye)12.5 μL,P1 1 μL(10 μM),P2 1 μL(10 μM),细菌DNA 1 μL，去离子水9.5 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30个循环；
最后72 ℃延伸5 min。
1.6 血清型鉴定和毒力因子检测
以水煮法提取分离菌株DNA为模板，按照参考文献[14]合成4组多重PCR全套引物，鉴定33个猪链球菌血清型(1～31型、33型、1/2型)。分别进行4组多重PCR扩增，用于分离菌株的血清型鉴定，回收阳性扩增条带，将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果与NCBI数据库中序列进行同源性比对。
按照参考文献[15]合成鉴定猪链球菌毒力因子引物(表1)，采用多重PCR对分离菌株进行毒力因子检测。反应体系：2XPCR Taq MasterMix(dye)12.5 μL,上游引物各0.2 μL(10 μM),下游引物各0.2 μL(10 μM),细菌DNA 1 μL，去离子水补至25 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；
最后72 ℃延伸7 min。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.7 药敏试验
以大肠杆菌(ATCC25922)为质控菌株，采用K-B法对分离菌株进行药敏试验。按照参考文献[16]方法，挑取纯化培养的单菌落接种于脑心浸液肉汤中，37 ℃培养12 h，用生理盐水将菌液浓度调整为0.5麦氏浊度标准(1.5×108CFU/mL)；
用灭菌棉签蘸取稀释好的菌液，均匀涂抹于血琼脂平板；
将药敏纸片贴于平板上，置于37 ℃培养箱培养18～24 h后，测定抑菌圈的直径，根据说明书标准对结果进行判定[16]。
表1 猪链球菌毒力因子PCR扩增引物序列
2.1 细菌的分离培养结果
解剖颅骨可见大脑组织局部出血明显(图1)，取病变的脑部组织进行瑞氏染色，油镜下可见单个、成对或者短链球菌(图2)。取病变脑部接种血琼脂平板，37 ℃培养24 h,可见白色或者灰白色、大小约1～1.5 mm、湿润、圆形菌落，呈α溶血现象。挑取分离纯化后的单菌落，革兰染色呈阳性、短链球菌(图3)。
图1 脑部出血性病变
图2 脑组织涂片，染色、镜检结果(1000×)
图3 分离菌株革兰染色结果(1000×)
2.2 细菌的PCR鉴定结果
对分离菌株进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂凝胶电泳后，凝胶成像系统观察结果，可见扩增条带在500～750 bp之间(图4)，与预期扩增大小689 bp一致，表明分离菌株为猪链球菌。
M: DNA相对分子质量标准(DL2000)；
1,2：分离菌株；
3：阴性对照
2.3 血清型鉴定和毒力因子检测
采用4组多重PCR对分离菌株进行扩增，结果表明在第一组多重PCR体系中，其扩增条带大小与8型猪链球菌的预期扩增大小268 bp一致(图5)，其他3组多重PCR均无扩增条带。将PCR产物回收后测序，并与NCBI数据库中序列进行同源性比对，显示分离菌株与NCBI数据库中8型猪链球菌的同源性大于95%，确定分离菌株即8型猪链球菌。
M: DNA相对分子质量标准(DL2000)；
1,2：分离菌株；
3：阴性对照
采用多重PCR对分离的8型猪链球菌进行毒力因子检测，结果显示，毒力因子sly对应预期扩增大小248 bp处出现扩增条带，而毒力因子mrp、epf分别对应预期扩增大小188bp、744 bp处均无扩增条带(图6)，表明该猪链球菌的毒力因子基因型为mrp-/epf-/sly+。
2.4 药敏试验
采用K-B法对分离菌株进行药敏试验，结果表明该分离菌株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、环丙沙星、复方新诺明等药物敏感，对四环素、强力霉素、红霉素耐药(表2)。根据药敏试验结果，针对本次病例可推荐青霉素、氨苄西林或者复方新诺明等进行治疗。
M: DNA相对分子质量标准(DL2000)；
1：分离菌株；
2：阴性对照
表2 分离菌的药敏试验结果
猪链球菌是重要的人兽共患病原体，可引起猪脑膜炎和败血症等症状，并能通过黏膜或者伤口等传播途径感染人[17],本研究表明，8型猪链球菌可导致仔猪脑膜炎并致死。急性脑炎型链球菌病早期发现比较困难，对于猪场来说，需要每天监测猪群2～3次。早期症状表现为耳朵朝后、眼睛斜视、犬坐姿势，尽早发现，早期治疗。仔猪脑膜炎型链球菌病在临床容易与仔猪伪狂犬病、仔猪水肿病相混淆，注意鉴别诊断。
迄今，已经鉴定了大约60种猪链球菌的毒力因子，其中荚膜多糖(CPS)、溶血素(SLY)、细胞外蛋白因子(EPF)、溶菌酶释放相关蛋白(MRP)被认为是猪链球菌的主要的毒力因子[18]，本研究中的猪链球菌毒力因子基因型为mrp-/epf-/sly+，Wisselink等[4]报道8型猪链球菌中有91%菌株呈mrp-/epf-毒力因子,基因型的研究结果一致。
药敏试验结果表明，8型猪链球菌对强力霉素、四环素、红霉素耐药，对青霉素类药物或磺胺类药物比较敏感，因此可采用青霉素联合地塞米松肌肉注射，或者大剂量磺胺类药物肌肉注射治疗。猪场出现病猪或者病死猪，可对同一圈舍的所有猪进行全群治疗，如可用阿莫西林饮水或者拌料，连用5～7 d。
本研究结果表明，8型猪链球菌可导致仔猪脑膜炎，且对强力霉素、四环素、红霉素等耐药，但是对头孢、青霉素或者磺胺类药物敏感，因此,此类药物可作为该病治疗的首选药物。
猜你喜欢猪链球菌血清型脑膜炎FDA批准15价肺炎疫苗Vaxneuvance预防6周龄至17岁人群侵袭性肺炎球菌病首都食品与医药(2022年21期)2022-12-06浅析猪链球菌病的诊治与防控措施中国动物保健(2022年10期)2022-11-04东莞地区B群链球菌的血清型与多位点序列型的分析医药前沿(2021年25期)2021-10-1616SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎早期诊断中的应用昆明医科大学学报(2021年5期)2021-07-22副猪嗜血杆菌河南分离株的优势血清型和毒力基因研究养猪(2020年6期)2021-01-27黄芩苷对猪链球菌体外抗菌活性试验中国猪业(2020年5期)2020-11-18Vaccination阅读与作文（英语初中版）(2020年5期)2020-05-21猪链球菌病的发病特点和防治方法兽医导刊(2020年3期)2020-03-16尼日尔脑膜炎流行已致76人死亡人民周刊(2016年9期)2016-05-26常德地区鸡场致病性大肠杆菌血清型鉴定江苏农业科学(2014年6期)2014-08-12本文来源：http://www.triumph-cn.com/fanwendaquan/gongwenfanwen/2023/0829/101445.html