孙建飞, 赵 悦, 尚孟慧, 毕 莹, 臧晓南
(中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室, 山东 青岛 266003)
节旋藻(Arthrospiraplatensis)属于蓝藻门(Cyanophyta)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Oscillaoriales),作为一种具有高营养价值的蓝藻而得到广泛关注和研究,其富含藻蓝蛋白,既是一种氨基酸组成齐全且必须氨基酸含量较高的蛋白质,也是一种天然色素。节旋藻还含有多糖、多种维生素和矿物质,有很好的抗肿瘤、抗病毒和抗辐射作用,被世界粮农组织誉为21世纪人类最理想的食品[1]。
光照是影响微藻生长的最重要的环境因子之一。光照对微藻的生长、细胞形态及胞内代谢产物的积累都有重要影响。近年来,对节旋藻光照培养条件有较多的研究,Tian等[2]研究了红蓝LED光对钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)光合有效辐射产藻蓝蛋白的影响,发现在固定光照强度下,红色和蓝色LED光源对节旋藻生长和有机物积累有不同的影响,蓝光有利于藻蓝蛋白的合成,红光有利于光合作用,促进生物量的积累,蓝光∶红光=3∶1时最适于生产藻蓝蛋白。徐明芳等[3]研究了LED光质和光照强度对钝顶螺旋藻生长和有机物积累的影响,发现红色光是藻类光合作用中最有效的光质,在红色光下,节旋藻的生长是最快的,干物质积累量最多,且组合少量其他光质更有利于有机物的积累。李默楠等[4]研究了LED不同光照条件对螺旋藻生长的影响,发现在光质组合实验中,红蓝光LED组合对藻株的生长和有机物积累明显优于传统荧光灯照明,光质组合条件最好的是蓝光(450～465 nm)+红光(650～660 nm),且红光对于节旋藻的生长速率影响明显高于蓝光,同时发现在一定范围内藻株生长速率同光照强度呈正比,但随着光照强度增加到达光饱和(540 μmol·m-2·s-1)时,节旋藻产量几乎不再变化。但是目前尚缺乏对不同形态的节旋藻品系培养和藻蓝蛋白、多糖等有机物积累的各种光照条件组合的系统研究。
本实验选取2个节旋藻品系A.platensisOUC 623和A.platensisOUC 793进行研究,原因是其生长速度快,活力旺盛,适应性好,且623藻株形态呈螺旋状,793呈直线状,具有明显的形态区别,便于了解不同形态的节旋藻藻株对光照条件的需求。本实验通过对光照周期、光照强度和红蓝LED光质组合进行单因子实验和正交实验,以藻株生物量、色素、多糖、藻蓝蛋白和蛋白的质含量为指标,得到最适光照条件组合,为节旋藻的产业化应用提供实验依据。
1.1 藻种及培养条件
1.1.1 藻种 本实验选用的节旋藻藻种A.platensisOUC 623和A.platensisOUC 793由中国海洋大学藻类遗传学实验室选育。
1.1.2 培养基及培养条件 本实验选用Zarrouk培养基[5]培养节旋藻。培养温度25 ℃,培养体系为在250 mL锥形瓶中加150 mL液体培养基和10 mL经活化的藻液,每天按时摇藻2次,藻液起始培养浓度为OD560=0.2。
1.2 实验方法
1.2.1 光照条件设置 分别设置不同的光照周期、不同的红蓝光组合及不同的光照强度的单因子实验,具体设置如下:
设置光照周期单因子实验条件为L8∶D16,L10∶D14,L12∶D12,L14∶D10,L16∶D8,在白色LED光照下培养,光照强度25 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃。
设置红蓝LED光组合单因子实验条件为白光、红∶蓝=1∶1、红∶蓝=2∶1、红∶蓝=4∶1、红∶蓝=6∶1、红∶蓝=8∶1,光照强度25 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃,光照周期L12∶D12。
设置蓝红LED光组合单因子实验条件为白光、蓝∶红=1∶1、蓝∶红=2∶1、蓝∶红=4∶1、蓝∶红=6∶1、蓝∶红=8∶1,光照强度25 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃,光照周期L12∶D12。
设置LED光照强度梯度单因子实验条件为5、15、25、35、45 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃,培养光照周期L12∶D12。
综合上述单因子条件下藻株生长和有机物积累情况,设置光照周期、光照强度和光质组合3因素3水平的L9(34)正交实验,培养温度25 ℃。
以上实验每组3个平行样,采用SPSS软件(SPSS 19.0)进行方差分析(AVONA)与多重比较(Duncan)分析,当P<0.05时认为差异有统计学意义。其中两组数据标注相同英文字母则表示两组数据间无显著性差异,两组数据标注不同英文字母则表示2组数据间有显著性差异。
1.2.2 生物量的测定 根据参考文献[6]紫外分光光度计测定的OD560与节旋藻细胞密度之间的回归方程为
y=0.642 7x+0.146 3。
(1)
式中:y是藻体干质量(g/L);x是OD560吸光度;相关系数R2=0.991 6>0.735。每隔1 d在固定时间中取摇匀的藻液3 mL,用紫外分光光度计测OD560的吸光度,根据回归方程得到单位体积藻液的生物量。
1.2.3 色素的测定 参考文献[7]并稍作改进,节旋藻加丙酮溶液后经细胞破碎,在紫外分光光度计中测OD663、OD646、OD470的吸光值,然后计算叶绿素a和类胡萝卜素的含量。
Ca=12.21VOD663-2.81VOD646,
(2)
Cx=(1 000VOD470-3.27Ca)/229。
(3)
式中Ca和Cx分别代表叶绿素a和类胡萝卜素的浓度(单位:mg/L)。再根据藻液浓度(单位:g/L),计算得到单位质量藻体中的色素含量(单位:mg/g)。
1.2.4 多糖的测定 根据参考文献[8]硫酸蒽酮法测定多糖含量,以葡萄糖制作标准曲线,节旋藻在PBS缓冲液中经细胞破碎后加入硫酸蒽酮试剂,在紫外分光光度计测VOD620处吸光度,根据标准曲线方程式(见式(4))和藻液浓度(g/L)的关系,计算得到单位质量藻体中的多糖含量。
y=1.393 4x-0.010 4。
(4)
式中:x是OD620处吸光度;y是多糖含量(单位:mg/mL);相关系数R2=0.998 5。
1.2.5 蛋白质含量的测定 参照Bradford改良方法[9],以牛血清白蛋白制作标准曲线,节旋藻在PBS缓冲液中经细胞破碎后,加入考马斯亮蓝试剂,在紫外分光光度计中测OD595,根据标准曲线(方程式见式(5))和藻液浓度(单位:g/L)的关系,计算得到单位质量藻体中的蛋白含量(单位:mg/g)。
y=161.52x-12.391。
(5)
式中:x是OD595处吸光度;y是蛋白质含量(单位:μg/mL);相关系数R2=0.994 1。
1.2.6 藻蓝蛋白含量的测定 根据文献[10]的PC藻蓝蛋白含量测定方法,节旋藻在PBS缓冲液中经细胞破碎后,在紫外分光光度计中测OD620和OD652处吸光值,代入式(5)计算藻蓝蛋白含量。再根据藻液浓度(单位: g/L),计算得到单位质量藻体中的藻蓝蛋白含量:
CPC=(VOD620-0.474VOD652)/5.43。
(6)
式中:VPC为单位质量藻体中的藻蓝蛋白含量(单位:mg/g)。
2.1 光照周期对节旋藻的影响
设置光照周期为L8∶D16、L10∶D14、L12∶D12、L14∶D10、L16∶D8,在白色LED光照下培养,光照强度25 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃。
2.1.1 生物量 由生长曲线(见图1)可知,螺旋形节旋藻(A.platensisOUC 623)和直线形节旋藻(A.platensisOUC 793)的生长都随着光照周期中光照时间的延长呈现先升高后下降的趋势,14 d时的生物量从高到低依次为L12∶D12>L14∶D10>L16∶D8>L10∶D14>L8∶D16,在光照周期为L12∶D12的条件下,2个藻株的生长速率最快,到培养的第14天,测得藻液浓度分别为(2.19±0.24)和(1.66±0.17) g/L。
(A:A. platensis OUC 623 生物量Biomass of A. platensis OUC 623;B:A. platensis OUC 793 生物量Biomass of A. platensis OUC 793.)图1 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的生物量随光照周期的变化Fig.1 Variation of biomass of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with photoperiod
2.1.2 色素含量 由图2可知,A.platensisOUC 623藻株的叶绿素a含量在光照L12∶D12和L14∶D10的条件下较高,在培养的第14天,分别为(10.54±1.45)和(15.19±1.64) mg/g;其类胡萝卜素在光照L14∶D10、L16∶D8的条件下较高,在培养的第14天分别为(4.19±0.40)和(4.06±0.38) mg/g。A.platensisOUC 793藻株叶绿素a含量在光照周期L14∶D10、L16∶D8的条件下较高,在培养的第14天分别为(12.39±1.16)和(12.94±1.01) mg/g;其类胡萝卜素在光照周期L14∶D10和L16∶D8时较高,在培养的第14天含量分别为(5.551±0.52)和(4.48±0.51) mg/g。
(A:A. platensis OUC 623叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 623;B:A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 623; C:A. platensis OUC 793 叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 793;D:A. platensis OUC 793 类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 793.)图2 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的色素含量随光照周期的变化Fig.2 Variation of pigment content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with photoperiod
2.1.3 多糖含量 从多糖含量结果显示(见图3),随着光照周期中光照时间的延长,藻株623和793都呈现出先升高后下降的变化规律,单位质量的藻株623在光照周期L12∶D12条件下多糖含量最高,单位质量的藻株793在光照周期L14∶D10时多糖含量最高,分别为(177.99±22.35)和(222.32±26.49) mg/g。
图3 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的多糖含量随光照周期的变化Fig.3 Variation of polysaccharides content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with photoperiod
2.1.4 蛋白质含量 从蛋白质含量结果显示(见图4),蛋白含量随光照周期中光照时间延长呈现先升高后下降的变化规律,单位质量的藻株623和793均在光照周期L10∶D14条件下蛋白质含量最高,分别为(158.59±15.89)和(282.09±39.34) mg/g。随着光照时间的进一步延长,2株藻株的蛋白含量都呈现下降趋势。其中藻蓝蛋白含量也呈现随光照周期中光照时间延长先升高后下降的变化规律,在光照周期L10∶D14条件下,单位质量的藻株623和793的藻蓝蛋白含量最高,分别为(8.65±0.94)和(15.96±2.32) mg/g。
图4 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的蛋白质和藻蓝蛋白含量随光照周期的变化Fig.4 Variation of protein and phycocyanin content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with photoperiod
2.2 不同比例红蓝LED光组合对节旋藻的影响
设置LED光组合为白光、红∶蓝=1∶1、红∶蓝=2∶1、红∶蓝=4∶1、红∶蓝=6∶1、红∶蓝=8∶1,光照强度25 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃,光照周期L12∶D12。
2.2.1 生物量 由图5所示,藻株623和793的生物量均随着红光比例的增加呈现先升高后下降的趋势,生物量积累按照从高到低的红蓝光比例是6∶1>8∶1>4∶1>2∶1>1∶1>白光,在红∶蓝=6∶1生长速率最高,培养第18天进入生长平台期,藻株623和793的藻液浓度分别为(2.12±0.19)和(1.97±0.18) g/L。
(A: A. platensis 623 生物量 Biomass of A. platensis 623; B: A. platensis 793 生物量Biomass of A. platensis 793.)图5 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的生物量随红蓝LED光比例的变化Fig.5 Variations of biomass of A. Platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of red and blue LED light
2.2.2 色素含量 由图6可知藻株623叶绿素a含量在LED白光和红∶蓝=6∶1时较高,在培养第18天到达平台期时,分别为(10.54±0.67)、(10.16±0.74) mg/g,藻株793叶绿素a含量在培养的前18天在LED白光和红∶蓝=6∶1时较高,在培养第18天分别为(9.23±0.51)、(8.84±0.50) mg/g,18 d后在红∶蓝=8∶1下的叶绿素a含量提高,超过LED白光和红∶蓝=6∶1,最大值为(8.89±0.63) mg/g。不同比例的LED红蓝光下,藻株623和793的类胡萝卜素含量差异不显著。
(A:A. platensis OUC 623叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 623;B:A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 623;C:A. platensis OUC 793叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 793;D:A. platensis OUC 793类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 793.)图6 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的色素含量随红蓝LED光比例的变化Fig.6 Variation of pigment content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of red and blue LED light
2.2.3 多糖含量 从多糖含量结果显示(见图7),适当比例的红蓝LED光有利于提高节旋藻中的多糖含量,单位质量的623和793藻株都在LED光红∶蓝=1∶1时多糖含量最高,分别为(208.92±16.57)和(90.71±5.87) mg/g,显著高于白光条件下节旋藻中的多糖含量(P<0.05)。随着红光比例的进一步增加,2个藻株的多糖含量都呈现下降趋势,在LED光为红∶蓝=6∶1和8∶1时的多糖含量同白光条件下接近,差异不显著(P>0.05)。
图7 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的多糖含量随红蓝LED光比例的变化Fig.7 The variation of polysaccharide content of A. Platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of red and blue LED light
2.2.4 蛋白质含量 从总蛋白质含量结果显示(见图8),适当比例的红蓝LED光有利于提高节旋藻中的蛋白含量,比例为1∶1、2∶1和4∶1的红蓝LED光条件下的总蛋白含量都显著高于白光(P<0.05),在LED光红∶蓝=1∶1时单位质量藻株623和793的蛋白质含量最高,分别为(284.79±27.51)和(159.15±15.61) mg/g。随着红光比重的进一步增加,2个藻株的蛋白含量都呈现下降趋势,在LED光红∶蓝=6∶1和8∶1时蛋白含量同白光条件下的蛋白含量接近,差异不显著(P>0.05)。
图8 A. platensis OUC 623和A. platensis OUC 793的蛋白质和藻蓝蛋白含量随红蓝LED光比例的变化Fig.8 Variation of protein and phycocyanin content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of red and blue LED light
对藻蓝蛋白含量的检测结果显示(见图8),在红∶蓝=1∶1时单位质量的藻株623和793的藻蓝蛋白含量最高,分别为(38.41±4.41)和(33.48±3.37) mg/g,显著高于白光(P<0.05)。随着红光比例的进一步增加,2个藻株的蛋白含量都呈现下降趋势,在红蓝比例大于4∶1的各组合LED光下的藻蓝蛋白含量同白光相近,差异不显著(P>0.05)。
2.3 不同比例蓝红LED光组合对节旋藻的影响
设置LED光组合:白光、蓝∶红=1∶1、蓝∶红=2∶1、蓝∶红=4∶1、蓝∶红=6∶1、蓝∶红=8∶1,光照强度25 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃,光照周期L12∶D12。
2.3.1 生物量 由图9所示,一定比例(1∶1、2∶1、4∶1、6∶1)的蓝红LED光也可以促进节旋藻藻株623和793的生长,生物量高于同样光照条件下的白色LED光。但是随着蓝光比例的增加,藻株623和793的生物量均呈现下降的趋势,2个藻株均是在LED光蓝∶红=1∶1时生长速率最高,在培养的第18天进入生长平台期,培养至第20天时藻液浓度分别为(1.71±0.14)和(1.42±0.09) g/L。
(A:A. platensis OUC 623 生物量Biomass of A. platensis OUC 623;B:A. platensis OUC 793 生物量Biomass of A. platensis OUC 793.)图9 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的生物量随蓝红LED光比例的变化Fig.9 Variation of biomass of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of blue-red LED light
2.3.2 色素含量 色素含量可知(见图10),藻株623和793叶绿素a和类胡萝卜素含量均随着蓝光比例的增加呈现下降的趋势,除793藻株叶绿素a含量在LED光蓝∶红=4∶1时最高外,其余均在LED光蓝∶红=1∶1时最高,其中在培养第20天分别为(7.88±0.56)、(4.83±0.45)、(8.95±0.71)、(4.22±0.46) mg/g。
(A:A. platensis OUC 623叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 623;B:A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 623;C:A. platensis OUC 793叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 793;D:A. platensis OUC 793类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 793.)图10 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的色素含量随蓝红LED光比例的变化Fig.10 The variation of pigment content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of blue to red LED light
2.3.3 多糖含量 多糖含量结果显示(见图11),藻株623和793的多糖含量都随着蓝光比例的增加呈现上升趋势。藻株623在蓝∶红为1∶1～8∶1的LED光照射下,多糖含量都高于白光,差异显著(P<0.05),在LED蓝∶红=6∶1时多糖含量最高,为(268.91±20.54) mg/g。藻株793在蓝∶红为1∶1～8∶1的LED光照射下,多糖含量都高于白光,差异显著(P<0.05),在LED蓝∶红=8∶1时多糖含量最高,为(185.25±17.87) mg/g。
图11 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的多糖含量随蓝红LED光比例的变化Fig.11 Variation of polysaccharide content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with the ratio of blue to red LED light
2.3.4 蛋白质含量 从总蛋白质含量结果显示(见图12A),623和793藻株的蛋白含量都随着蓝光比例的增加呈现上升趋势,且蓝∶红>1∶1的LED光照射下的蛋白含量都显著高于白光(P<0.05)。在LED光蓝∶红=8∶1时单位质量藻株623和793的蛋白质含量最高,分别为(657.98±76.25)和(610.23±87.13) mg/g。
图12 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的蛋白质和藻蓝蛋白含量随蓝红LED光比例的变化Fig.12 Variation of protein and phycocyanin content of A.platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with blue-red LED light ratio
藻蓝蛋白含量同样也随着蓝光比例的增加呈现上升趋势(见图12B),在蓝光照射下的藻株的藻蓝蛋白含量都显著高于白光(P<0.05)。在LED光蓝∶红=8∶1时单位质量的623的藻蓝蛋白含量最高,含量为(51.26±5.86) mg/g,在LED光蓝∶红=6∶1时单位质量的793藻株藻蓝蛋白含量最高,含量为(110.21±12.26) mg/g。
2.4 LED光组合的不同光照强度对节旋藻的影响
根据2.2和2.3的实验结果,选取了对生长促进显著的红∶蓝=6∶1组合和对有机物积累促进显著的蓝∶红=6∶1的LED光组合进行光照强度的研究,分别设置光照强度梯度5、15、25、35、45 μmol·m-2·s-1,培养温度25 ℃,光照周期L12∶D12。
2.4.1 生物量 由图13所示:藻株623和793在红∶蓝=6∶1和蓝∶红=6∶1的LED光组合的生长速率均随着光照强度的增加而提高,在光照强度35和45 μmol·m-2·s-1时生长速率最高;在培养至第18天时,45 μmol·m-2·s-1条件下,藻株623在红∶蓝=6∶1和蓝∶红=6∶1的LED光组合下藻液浓度最高分别为(2.21±0.21)和(1.85±0.16) g/L,藻株793在红∶蓝=6∶1和蓝∶红=6∶1的LED光组合下藻液浓度最高分别为(1.88±0.17)和(1.42±0.12) g/L。
(A:LED光红∶蓝=6∶1时A. platensis OUC 623生物量 Biomass of A. platensis OUC 623 in LED light of red∶blue = 6∶1;B:LED光蓝∶红=6∶1 A. platensis OUC 623生物量 Biomass of A. platensis OUC 623 in LED light of blue∶red=6∶1;C:LED光红∶蓝=6∶1时A. platensis OUC 793生物量 Biomass of A. platensis OUC 793 in LED light of red∶blue=6∶1;D:LED光蓝∶红=6∶1 A. platensis OUC 793生物量 Biomass of A. platensis OUC 793 in LED light of blue∶red=6∶1.)图13 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的生物量随LED光组合光照强度的变化Fig.13 Variation of biomass of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with light intensity of LED light combination
2.4.2 色素含量 对色素含量的检测可知(见图14),藻株623和793在不同光照条件下的变化相似,在LED光红∶蓝=6∶1条件下,叶绿素含量和类胡萝卜素含量均在5 μmol·m-2·s-1时最低,差异显著(P<0.05),大于5 μmol·m-2·s-1各组的含量相近,差异不显著(P>0.05);在LED光蓝∶红=6∶1条件下,叶绿素a含量和类胡萝卜素含量均在光照强度为5 μmol·m-2·s-1时最低,差异显著(P<0.05),大于光照强度为25 μmol·m-2·s-1各组的含量相近,差异不显著(P>0.05)。
(A:LED光红∶蓝=6∶1时A. platensis OUC 623叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 623 in LED light of red∶blue=6∶1;B:LED光蓝∶红=6∶1时A. platensis OUC 623叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 623 in LED light of blue∶red=6∶1;C:LED光红∶蓝=6∶1时A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 623 in LED light of red∶blue=6∶1;D:LED光蓝∶红=6∶1时A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 623 in LED light of blue∶red=6∶1;E:LED光红∶蓝=6∶1时A. platensis OUC 793叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 793 in LED light of red∶blue=6∶1;F:LED光蓝∶红=6∶1时A. platensis OUC 793叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 793 in LED light of blue∶red=6∶1;G:LED光红∶蓝=6∶1时A. platensis OUC 793类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 793 in LED light of red∶blue=6∶1;H:LED光蓝∶红=6∶1时A. platensis OUC 793类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 793 in LED light of blue∶red=6∶1.)图14 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的色素含量随LED光组合光照强度的变化Fig.14 Variation of pigment content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with light intensity of LED light combination
2.4.3 多糖含量 从多糖含量结果显示(见图15),在红∶蓝=6∶1的光照条件下,藻株623和793的多糖含量都表现出随光照强度的增加先升高后下降的趋势,单位质量的藻株623在光照强度为25 μmol·m-2·s-1时多糖含量最高,含量为(83.74±9.77) mg/g;在光照强度为35 μmol·m-2·s-1时,单位质量的藻株793多糖含量最高,含量为(55.69±3.83) mg/g。
图15 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的多糖含量随LED光质组合光照强度的变化Fig.15 Variation of polysaccharide content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793 with light intensity of LED light combination
在LED蓝∶红=6∶1的光照条件下,藻株623和793的多糖含量都表现出随光照强度的增加逐渐升高的趋势,藻株623在光照强度为35 μmol·m-2·s-1时多糖含量最高,为(141.26±13.88) mg/g。藻株793在光照强度为45 μmol·m-2·s-1时多糖含量最高,为(46.01±6.79) mg/g。
2.4.4 蛋白质含量 从总蛋白质含量结果显示(见图16),在红∶蓝=6∶1和蓝∶红=6∶1的LED光照条件下,藻株623和793的多糖含量基本都表现出随光照强度的增强而下降的趋势,且在光照强度为5 μmol·m-2·s-1时蛋白质含量最高。光照强度为5 μmol·m-2·s-1时在红∶蓝=6∶1和蓝∶红=6∶1的LED光组合下,单位质量的藻株623蛋白质含量分别为(123.37±10.16)和(407.81±61.93) mg/g;在红∶蓝=6∶1的LED光组合下,光照强度为5 μmol·m-2·s-1时单位质量的藻株793蛋白含量最高,为(204.54±24.37) mg/g;在蓝∶红=6∶1的LED光组合下,光照强度为15 μmol·m-2·s-1时单位质量的藻株793蛋白含量最高,为(247.04±33.07) mg/g。
图16 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的蛋白质和藻蓝蛋白含量随LED光质组合光照强度的变化Fig.16 Variation of protein and phycocyanin content of A.platensis OUC 623 and A.platensis OUC 793 with light intensity of LED light combination
从藻蓝蛋白含量结果显示(见图16),光照强度为5 μmol·m-2·s-1时,单位质量的藻株623在红∶蓝=6∶1和蓝∶红=6∶1的LED光组合条件下藻蓝蛋白含量最高,含量分别为(9.30±0.69)和(28.48±3.50) mg/g;光照强度为5 μmol·m-2·s-1时,单位质量的藻株793在红∶蓝=6∶1的LED光组合条件下藻蓝蛋白含量最高,含量分别为(19.89±2.64) mg/g;光照强度为5、15、25 μmol·m-2·s-1时,单位质量的藻株793蓝∶红=6∶1的LED光组合条件下,藻蓝蛋白含量都较高,差异不显著(P>0.05),其中光照强度为15 μmol·m-2·s-1时藻株793的藻蓝蛋白含量均值最高,为(34.52±3.44) mg/g。
2.5 光照周期、光照强度和光质组合的正交实验
综合上述藻株生长和有机物积累情况,设置光照周期、光照强度和光质组合3因素3水平的L9(34)正交实验表(见表1),培养温度25 ℃,每组3个平行实验。
表1 正交实验设计表Table 1 Orthogonal experimental design table
2.5.1 生物量 由图17可知,藻株623在2号实验组中生长速率最高,该组的实验条件为光照周期L12∶D12,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合红∶蓝=6∶1,培养的第22天左右进入生长平台期,藻液浓度为(1.96±0.14) g/L。从正交实验结果分析,对藻株623生长的主次影响因素是光质组合>光照强度>光照周期。根据正交实验结果分析(见表2),获得最优的组合为C2B2A3,即光照周期为L16∶D8,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合红∶蓝=6∶1。
表2 A. platensis OUC 623生长速率正交实验极差分析表Table 2 Range analysis table of growth rate of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment
(A:A. platensis OUC 623的生长曲线Growth curve of A. platensis OUC 623 biomass;B:A. platensis OUC 793的生长曲线Growth curve of A. platensis OUC 793 biomass)图17 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的生长的正交实验Fig.17 Orthogonal experiment of growth of A. Platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793
藻株793在6号实验组中生长速率最高,即光照周期L14∶D10,光照强度45 μmol·m-2·s-1,LED光组合红光∶蓝光=6∶1,在培养的第22天左右进入生长平台期,藻液浓度为(1.31±0.09) g/L,从正交实验结果分析显示,对藻株793生长的主次影响因素是光组合>光照强度>光照周期。根据正交实验结果分析(见表3),获得最优的组合为C2B3A2,即光照周期L14∶D10,光照强度为45 μmol·m-2·s-1,光组合红光∶蓝光=6∶1,与实验最优组合一致。
表3 A. platensis OUC 793生长速率正交实验极差分析表Table 3 Range analysis table of growth rate of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment
2.5.2 色素含量 由色素含量(见图18)可知,藻株623在2号实验组,即光照周期为L12∶D12,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合红∶蓝=6∶1,叶绿素a含量和类胡萝卜素含量都最高,在培养第22天含量分别为(4.92±0.37)和(2.72±0.22) mg/g。
(A:正交实验A. platensis OUC 623叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment; B:正交实验A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment;C:正交实验A. platensis OUC 793叶绿素a含量Chlorophyll a content of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment;D:正交实验A. platensis OUC 793类胡萝卜素含量Carotenoid content of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment.)图18 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的色素含量正交实验Fig.18 Orthogonal experiment on pigment content of A. platensis OUC 623 and A. platensis OUC 793
根据正交实验结果分析(见表4、5),藻株623叶绿素a含量和类胡萝卜素含量积累的最优组合分别为C2B2A1和B2A1C2,即光照周期为L12∶D12,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1,与实验最优结果一致。
表4 A. platensis OUC 623叶绿素a含量正交实验极差分析表Table 4 Range analysis table of chlorophyll a content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment
表5 A. platensis OUC 623类胡萝卜素含量实验极差分析表Table 5 Range analysis table of carotenoid content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment
藻株793在6号实验组,即光照周期为L14∶D10,光照强度为45 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1下,叶绿素a含量和类胡萝卜素含量都最高,在培养第22天含量分别为(2.82±0.17)和(2.03±0.15) mg/g。根据正交实验结果分析(见表6、7),藻株793叶绿素a含量和类胡萝卜素含量积累的最优组合为A2B3C2,即光照周期为L14∶D10,光照强度为45 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1,与实验最优结果一致。
表6 A. platensis OUC 793叶绿素a含量正交实验极差分析表Table 6 Range analysis table of chlorophyll a content of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment
表7 A. platensis OUC 793类胡萝卜素含量实验极差分析表Table 7 Range analysis table of carotenoid content of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment
2.5.3 多糖含量 从多糖含量结果显示(见图19),单位质量的藻株623和793均在8号实验组中多糖含量最高,即光照周期为L16∶D8,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合为蓝∶红=6∶1,含量分别为(275.79±39.92)和(187.38±20.60) mg/g,从正交实验结果分析显示,对藻株623的多糖积累的主次影响因素是光照周期>光质组合>光照强度(见表8),对藻株793生长的主次影响因素是光照强度>光照周期>光质组合(见表9)。根据正交实验结果分析(见表8、9),藻株叶绿素a含量和类胡萝卜素含量积累的最优组合分别为A3C3B2和B2A3C3,即8号实验组的光照条件,与实验最优结果一致。
表8 A. platensis OUC 623多糖含量正交实验极差分析表Table 8 Range analysis table of polysaccharides content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment
表9 A. platensis OUC 793多糖含量正交实验极差分析表Table 9 Range analysis table of polysaccharides content of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment
图19 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的多糖含量正交实验Fig.19 Orthogonal experiment on the content of polysaccharides in A.platensis OUC 623 and A.platensis OUC 793
2.5.4 蛋白质含量 从蛋白含量结果(见图20)显示,单位质量的藻株623和793均在4号实验组中蛋白含量最高,即光照周期为L14∶D10,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,LED光为蓝光∶红光=6∶1,二者分别为(197.60±20.51)和(361.86±37.53) mg/g,从正交实验结果分析显示,对藻株623的蛋白积累的主次影响因素是光质组合>光照强度>光照周期(见表10),对藻株793蛋白质积累的主次影响因素是光质组合>光照周期>光照强度(见表11)。根据正交实验结果分析,获得这2个藻株蛋白质积累的最优光照组合均为A2B1C3,即光照周期为L14∶D10,光照强度为25 mg/g,LED光组合为蓝∶红=6∶1,与实验最优结果一致。
表10 A. platensis OUC 623蛋白质含量正交实验极差分析表Table 10 Range analysis table of protein content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment
表11 A. platensis OUC 793蛋白质含量正交实验极差分析表Table 11 Range analysis table of protein content of A. platensis OUC 793 in orthogonal experiment
图20 A. platensis OUC 623 和A. platensis OUC 793的蛋白质和藻蓝蛋白含量正交实验 Fig.20 Orthogonal experiment of protein and phycocyanin content of A.platensis OUC 623 and A.platensis OUC 793
从藻蓝蛋白含量结果显示(见图20),单位质量的藻株623在3号实验组中藻蓝蛋白含量最高,即光照周期为L12∶D12、光照强度为45 μmol·m-2·s-1、LED光组合为蓝∶红=6∶1,含量为(38.52±4.22) mg/g,从正交实验结果分析显示(见表12),对藻株623藻蓝蛋白积累的主次影响因素是光质组合>光照周期>光照强度。根据正交实验结果分析,获得最优的组合为C3A1B1,即光照周期为L12∶D12,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,光组合蓝∶红=6∶1。
表12 A. platensis OUC 623藻蓝蛋白含量正交实验极差分析表Table 12 Range analysis table of phycocyanin content of A. platensis OUC 623 in orthogonal experiment
单位质量的藻株793在4号实验组条件下藻蓝蛋白含量最高,即光照周期为L14∶D10,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,光组合为蓝∶红=6∶1,含量为(51.19±3.78) mg/g,从正交实验结果分析显示(见表13),对藻株793的藻蓝蛋白积累的主次影响因素是光质组合>光照强度>光照周期。根据正交实验结果分析,获得最优的组合为C3B1A2,即光照周期为L14∶D10,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,LED光组合为蓝∶红=6∶1。
表13 A. platensis OUC 973藻蓝蛋白含量正交实验极差分析表Table 13 Range analysis table of phycocyanin content of A. platensis OUC 973 in orthogonal experiment
2.5.5 正交实验的验证实验 在正交实验中,A.platensisOUC 623的生物量和藻蓝蛋白含量经正交结果分析获得的理论最优组合与实验组的最优组合不一致,因此我们对正交实验得到的优化结果进一步验证。
根据验证实验结果,藻株623的生长最适条件应取2号实验组(A.platensisOUC 623验证实验的生物量为(1.27±0.08) mg/g,理论最优组合实验的生物量为(1.31±0.09) mg/g),即选择光照周期为L12∶D12,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1;藻蓝蛋白积累最适条件取理论最优组合,含量为(42.57±1.42) mg/g,高于3号实验组,即选择光照周期为L12∶D12,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,LED光组合为蓝∶红=6∶1;蛋白质积累最适条件取4号实验组,即选择光照周期为L14∶D10,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,LED光组合为蓝∶红=6∶1;多糖积累最适条件取8号实验组,含量为(275.79±39.92) mg/g,即选择光照周期为L16∶D8,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合为蓝∶红=6∶1;色素积累(叶绿素a和类胡萝卜素)的最适光照条件与生长一样,取2号实验组,即选择光照周期为L12∶D12,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1(见表14)。藻株793的生长最适条件应取6号实验组,即选择光照周期为L14∶D10,光照强度为45 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1,藻蓝蛋白和蛋白质积累最适条件取4号实验组,即选择光照周期为L14∶D10,光照强度为25 μmol·m-2·s-1,LED光组合蓝∶红=6∶1,多糖积累最适条件取8号实验组,即选择光照周期为L16∶D8,光照强度为35 μmol·m-2·s-1,LED光组合为蓝∶红=6∶1;色素积累(叶绿素a和类胡萝卜素)的最适光照条件与生长一样,取6号实验组,即选择光照周期为L14∶D10,光照强度为45 μmol·m-2·s-1,LED光组合为红∶蓝=6∶1(见表15)。
表14 A. platensis OUC 623最优培养方案Table 14 Optimal culture conditions for A. platensis OUC 623
表15 A. platensis OUC 793最优培养方案Table 15 Optimal culture conditions for A. platensis OUC 793
本实验从生物量、色素含量、多糖含量、藻蓝蛋白含量、蛋白质含量等方面探索了节旋藻培养的最适光照周期,光照强度,LED光质组合条件。实验中发现红光LED可以提高藻株的叶绿素和类胡萝卜素的含量,进而提高藻株生长速率,蓝光LED会促进积累多糖、蛋白质等有机物,实验中623藻株在红∶蓝=6∶1的LED光组合下比相同条件的白色LED光生物量提高了90.74%,在蓝∶红=6∶1的LED光组合下,藻蓝蛋白、蛋白质、多糖的积累量较白色LED光分别提升了358.84%、342.11%、168.26%;793藻株在红∶蓝=6∶1的LED光下比相同条件的白色LED光生物量提高了61.74%,在蓝∶红=6∶1的LED光下,藻蓝蛋白、蛋白质、多糖的积累量较白色LED光分别提升了352.79%、955.42%、208.11%,这同Tian等[2]在基于光合有效辐射的红色和蓝色LED光对钝顶螺旋藻藻蓝蛋白生产的影响所得到的结论一致。
在短时间光照,低光照强度等光照不足的条件下,节旋藻中藻蓝蛋白的含量显著提升,藻蓝蛋白作为一种捕光色素蛋白,它的光吸收区在橙黄光区(615～640 nm),因此在叶绿素基础上,藻蓝蛋白能吸收更多波长的光能,这使节旋藻能够更好地适应水下低光照的条件。以往的研究中也发现在节旋藻中存在着补光适应情况,即在外界光照条件改变时,藻株的藻胆蛋白组成也会随之发生改变,金怡雯[16]认为节旋藻在低光强(高于光补偿点)的情况下,节旋藻的藻胆蛋白的合成会增加,是藻株对光限制的一种适应行为,藻胆蛋白的含量增加可以保证藻株光合作用的正常进行,同时发现在光照不足的条件下,藻株的叶绿素a等同光合作用直接相关的色素含量并没有明显升高,但藻蓝蛋白含量明显增加,推测原因是为了满足藻株在低光照下的生长,在叶绿素a和类胡萝卜素吸收的光能无法满足藻株生长需求的情况下,节旋藻就更倾向于合成更多的藻蓝蛋白,以吸收更大波长范围的光,维持自身的生长和有机物合成,即在光照条件不足的情况下,节旋藻进行补光适应,此时更偏向于合成藻蓝蛋白,捕获更多的光能,这与Lee等[17]在LED光源培养节旋藻生产高纯度藻蓝蛋白的实验结论一致。
据实验结果显示,叶绿素a和类胡萝卜素的含量与生长速率正相关,即在生长速率快的光照条件下,色素的含量较高。在藻株光合作用的过程中,在类囊体膜上由光系统Ⅰ、光系统Ⅱ、细胞色素b6f蛋白复合体和其他光合相关的元件构成的电子传递链,其中叶绿素a和类胡萝卜素起到了非常重要的捕光作用,适宜的光照条件会促进叶绿素a和类胡萝卜素的合成,从而促进了藻株的生长。当光照不足时,叶绿素和类胡萝卜素含量均下降,不利于捕光和光合作用;而在过度光照的条件下,节旋藻会消耗自身的一部分能量来保护藻细胞和光合系统,甚至发生光抑制现象,使光合作用被抑制,Heber等[18]发现在高光照强度条件下,光系统Ⅱ中心蛋白(DI)会被消耗,从而降低了捕光复合体到光系统Ⅱ的能量传递效率。因此过度光照和光照不足时,都会不利于藻株的生长。Markou[19]利用不同波长的光(绿、蓝、红、白、黄、粉)培养节旋藻,发现在粉色和红色光下生物量最高,而蓝光最低,原因是粉色光接近于叶绿素的435 nm处的吸收峰,红光接近于藻蓝蛋白(620 nm)和叶绿素的另一个676 nm处的吸收峰,这同本实验中红色LED比蓝色LED更有利于节旋藻生长相一致。Markou[19]还发现藻蓝蛋白和叶绿素的含量在不能为生物质合成提供足够光能的波长(如蓝色和绿色)中较高,因为这些波长的光不能提供足够的光能,可以认为是光合作用细胞的暗环境,需要额外合成藻蓝蛋白和叶绿素捕获光能。与藻蓝蛋白和叶绿素含量相比,类胡萝卜素含量不受所用光波长的影响。而在本研究中,藻蓝蛋白的含量是在蓝色光比例高的光质条件下较高,但是叶绿素含量和类胡萝卜素含量都是在红色光比例高的光质条件下更高,而且类胡萝卜素在不同比例的蓝红LED光中会随着蓝光比例的增加而下降。这可能是因为本实验设置的是红色和蓝色的LED组合光,与单一光质不同,不同光质的组合可能带来细胞内的协同作用,可以获得更丰富的结果。
本文研究了2种形态的节旋藻,螺旋形节旋藻623和直线形节旋藻793,发现他们对光照条件的响应并不完全相同,藻株623的生长和藻蓝蛋白的积累相较于藻株793更适宜短时间和较弱强度的光照,光照周期为L12∶D12,光照强度为35 μmol·m-2·s-1的623藻株浓度最高,793藻株浓度在光照周期L14∶D10,光照强度45 μmol·m-2·s-1时最高,在光照周期为L12∶D12,光照强度为25 μmol·m-2·s-1时藻株623的藻蓝蛋白含量最高,793藻株在光照周期为L14∶D10,光照强度为25 μmol·m-2·s-1时藻蓝蛋白含量最高,可能的原因是藻株623更不耐受长时间高强度的光照,也因此其形态会呈弯曲螺旋形,以增加藻体之间的遮盖率来减少光照造成的伤害,藻株793更能耐受长时间高强度的光照,因其形态呈直线形,可以提高光照面积,增加光合效率。Teruo[20]通过实验证明了高光强会造成藻株光系统Ⅱ损伤,节旋藻在高光强下藻体螺旋会收紧,是藻株应对光损伤的一种自我保护措施,根据沈晓文等[21]的实验证明,当光照条件改变时,节旋藻螺旋形态会发生改变,且在培养的过程中长期保持稳定。Mao等[22]发现,在红光和蓝光为8∶2的组合条件下,节旋藻的碳水化合物、蛋白质、藻蓝蛋白、油脂积累均高于白光条件,且发现节旋藻的长度、直径、螺距均显著小于白光条件,其分析原因为在红蓝组合光下,节旋藻基因表达发生变化,从而收紧螺旋相互遮盖减少光辐射。Gao等[23]发现,当光照条件不适合节旋藻生长时,即在UV-B下,藻株总是具有较短的长度和较高的螺旋紧密度等特征。究其原因是藻丝的长度越长,螺旋度越小,对节旋藻造成的光质压力就越小,在其研究中发现藻类暴露在较高的UV-B辐射下,其DNA分子确实被降解了,这是藻丝断裂的一个重要原因。这都与本实验的结论基本一致,而本实验中设置了更为系统的光照组合,更为具体地探索出了LED红蓝光组合及光照时间和光照强度对2种不同形态的节旋藻生长和有机物的积累。此外,经优化光照条件后,623藻株表现出生长速度快的优势,在培养周期内生物量积累较多,多糖含量较高,但是其蛋白含量和藻蓝蛋白含量都不如藻株793含量高。不同的藻株表现出不同的优势,这为满足节旋藻产业化需求提供了更多选择。
中国已成为全球第一大微藻生产国,微藻产业中80%以上为节旋藻,节旋藻产业水平的提升对于微藻产业的可持续发展有重要意义。LED光源具有体积小、寿命长、效率高、能耗低等优点。在本研究中,不同红蓝比例的LED光具有促进藻细胞的生长及多糖、蛋白质等有机物积累的作用,在节旋藻生产中可以根据对产物的需求调节LED光的使用,从而使生产率提高、养殖能耗降低,达到高产、节能的目标,具有经济效益和生态价值。
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