方唯炜，应汉杰，蒋敬庭
肿瘤的发病率和死亡率不断升高，其中肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌是最常见的肿瘤，已成为主要死因[1]。肿瘤的主要特征是不受控制、侵袭性的细胞生长，这是由肿瘤抑制基因的下调和（或）肿瘤促进基因的上调驱动的[2]。目前常见的肿瘤治疗方法包括手术、化疗、放疗、靶向疗法和免疫疗法等，然而这些疗法主要适用于患有局部病灶或对特定治疗敏感的肿瘤患者，因此单一种类的疗法具有很大的局限性[3]。
虫草属（Cordyceps）是一类寄生于节肢动物的真菌，虫草通过调节寄主的生命周期来逃逸寄主免疫系统的监视，从而达到生存和繁殖的目的[4]。目前针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis）和蛹虫草（Cordyceps militaris）的研究最为广泛。冬虫夏草因其特殊的生命周期而得名，其常被用作传统中药并发挥多种药理活性[5]。蛹虫草由子实体和菌核两部分组成，其子实体中含有各种活性成分，包括虫草素、腺苷、虫草多糖等[6]。虫草素又称 3"-脱氧腺苷，是一种由腺嘌呤和脱氧戊糖组成的腺苷衍生物。虫草素由Cunningham 等[7]首次从蛹虫草中分离得到，是第一个从真菌中分离的核苷类抗生素。在传统工艺中，虫草素主要从天然的蛹虫草中提取，产量、纯度较低。随着提取技术的提升，目前虫草素的主要合成方法包括化学合成、微生物发酵、体外合成和生物合成。由于合成生物学的广泛应用，虫草素的生物合成途径得到阐明，促进了虫草素的大规模生产和商业化[8]。虽然虫草素最早被用作肿瘤化疗药物，但是虫草素的抗肿瘤机制尚未完全清楚，其诱导的信号通路机制有待进一步研究[9]。
腺苷是一种信号分子，由能量消耗过程中 ATP 降解产生，其浓度的改变会对脉管系统、免疫逃逸和肿瘤生长产生深远的影响[10]。腺苷通过其受体抑制 NK 细胞、DC 细胞等发挥功能，同时增强免疫抑制细胞的活性，参与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）免疫耐受的形成。同时，腺苷作用于血管内皮细胞及基质细胞，促进 TME 新生血管的形成，为肿瘤转移提供必要条件[11]。腺苷通路的组成主要包括参与 TME 中腺苷生成和信号传导的胞外核苷酸酶（CD39 和 CD73）和腺苷受体（A1R、A2AR、A2BR和 A3R）[12]。目前，针对该通路的抗肿瘤药物正在作为单一药物进行研究，并且以与抗 PD-1 或抗 PD-L1 疗法联合的治疗策略进行临床试验（NCT02503774、NCT02740985）。腺苷类似物包括修饰的腺嘌呤和腺苷的核糖环，与腺苷相比，腺苷类似物有时具有更高的生物活性和受体亲和选择性[13]。就目前的研究来看，虫草素作为一种腺苷类似物，在肿瘤治疗中并未产生和腺苷一样的免疫抑制效果。相反，其抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移，其中具体机制有待进一步研究。
1.1 抑制核酸生物合成，终止蛋白质翻译
研究表明，虫草素进入细胞并转化为结构与 AMP、ADP、ATP 相似的磷酸盐形式（一磷酸虫草素、二磷酸虫草素和三磷酸虫草素），并且抑制细胞内 RNA 聚合酶 I、II、III 的活性，导致 RNA 链合成的终止[14-15]。在哺乳动物成纤维细胞中，虫草素进入细胞后可减少部分 mRNA 的poly(A) 尾巴长度，抑制 3" 端mRNA 的加工，从而阻滞RNA 的合成；
在 HeLa 细胞中，通过测量经虫草素处理后的放射性氨基酸掺入，表明虫草素是蛋白翻译的强抑制剂[16]。有研究证实经过腺苷激酶磷酸化后的虫草素存在较高的生物活性，在多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中，由于虫草素的化学结构缺少 RNA 链延伸所需的 3"-羟基，导致 MM 细胞的 RNA 合成水平下降，造成 MM 细胞死亡[17]。目前已有多项研究对虫草素的作用机制进行探讨。
有研究发现，虫草素的作用机制是剂量相关的：在低剂量下抑制多聚腺苷磷酸化；
在高剂量下激活5"-腺苷一磷酸活化蛋白激酶（5"-adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）[16]。AMPK 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞内能量代谢稳态的主要调节因子[18]。研究表明，虫草素以一磷酸虫草素的形式激活细胞中的AMPK 信号通路[15-16]，抑制哺乳动物雷帕霉素靶点复合物 1（mammalian target-of-rapamycin complex-1，mTORC1），终止蛋白质的翻译，从而抑制肺癌细胞的生存、迁移和侵袭[19]。
1.2 诱导肿瘤细胞凋亡、促进自噬
细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，通常由内源性或外源性刺激造成；
内源性刺激主要包括活性氧和内质网应激，而外源性细胞凋亡主要由死亡受体（death receptor，DR）介导[20]。一项研究证实虫草素可能通过 PLC/PKC 通路诱导小鼠间质瘤细胞凋亡，但同时该研究结果显示 PKC 抑制剂只能抑制少数细胞死亡，提示其他途径可能也参与虫草素诱导细胞凋亡的过程[21]。据报道，虫草素参与由 DR 介导的外源性细胞凋亡，主要是通过其诱导 DR 下游活化的caspase-8 直接切割并激活 caspase-3，启动 caspase 级联反应[22-23]。Lee 等[22]的研究中，经过虫草素治疗的人结肠癌细胞 HT-29 中 DR3、caspase-8 和裂解的 caspase-1 蛋白表达增加，揭示了虫草素可通过 DR3 途径诱导细胞凋亡。在多项研究中，虫草素诱导由 Bax 易位触发的内在凋亡途径，导致细胞色素 c 由线粒体向细胞质释放，激活caspase-9[24-25]。
腺苷受体（adenosine receptors，ARs）在细胞存活和死亡的调控中起着重要作用，腺苷 A3 受体的活化能够抑制肿瘤的生长，故可作为一种治疗肿瘤的靶标[26]。有研究证实[27]虫草素对小鼠黑色素瘤和肺癌细胞系的生长显示出显著的抑制作用；
针对机制的反向验证证实在使用选择性腺苷A3 受体拮抗剂后，虫草素对肿瘤生长的抑制作用被减弱：表明虫草素通过刺激肿瘤细胞上的腺苷 A3 受体对小鼠黑色素瘤和肺癌细胞的生长具有抑制作用。在卵巢癌的研究中，Cui 等[28]发现虫草素通过下调 C-C 趋化因子配体 5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）来抑制 AKT 介导的 NF-κB 转录因子的激活，进而激活 JNK 信号通路引发细胞凋亡。MAPK 通路涉及多种蛋白，如细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNKs）、p38 MAP 激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）[29]。有研究证实，抑制 p38 MAPKs 可有效下调虫草素治疗后的小鼠睾丸间质瘤细胞凋亡，提示 p38 通路可能在虫草素诱导的MA-10 细胞凋亡中起关键作用[30]。Baik 等[31]的研究证实，使用 ERK 抑制剂、JNK 抑制剂和 p38 MAPK 抑制剂可以削弱虫草素对人胶质母细胞瘤 U87MG 细胞系的抑制作用，表明 MAPK 通路可能参与由虫草素诱导的对 U87MG细胞增殖的抑制和凋亡的促进。
自噬是一种从酵母到哺乳动物共存的保守进化的分解代谢机制，主要通过溶酶体途径降解细胞质成分和细胞器[32]。当肿瘤细胞遇到 DNA 损伤、缺氧、饥饿或化疗药物时，AMPK 通路被激活，从而驱动自噬。自噬被证实具有促进、抑制的双重作用：在肿瘤发生的早期抑制肿瘤生长，但在肿瘤发生和治疗的后期促进肿瘤进展[33-34]。因此，自噬可以作为各个阶段肿瘤预防和治疗有效干预策略，限制肿瘤的发生和发展。虫草素通过自噬机制可能在肿瘤治疗过程中发挥重要作用。在卵巢癌细胞中，虫草素通过抑制 β-连环蛋白信号通路来激活 Dickkopf 相关蛋白 1（dickkopf-related protein 1，Dkk1）相关的自噬；
并且虫草素通过诱导卵巢癌细胞自噬来促进 caspase-3 的裂解，促进凋亡[35]。另一项研究表明，虫草素通过平衡核苷转运蛋白（equilibrative nucleoside transporters，ENT1）穿过卵巢癌细胞膜并激活 AMPK，活化的 AMPK 向下游靶蛋白发出信号以诱导自噬，引起细胞死亡[36]。由于微管相关蛋白轻链 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）信号的积累可能是加速自噬流或阻断自噬降解所致，一项研究证实经虫草素治疗后人妊娠绒毛膜癌 JAR 细胞中的 LC3 信号显著增加，说明虫草素加速 JAR 细胞自噬。并且该研究用虫草素和自噬抑制剂氯喹共同处理 JAR 细胞，在此情况下细胞存活增加，证实了虫草素诱导 JAR 细胞自噬激活、抑制细胞生长[37]。尽管一些详细的机制已经得到阐述，但仍然需要进行相关体外和体内的研究揭示虫草素激活自噬对肿瘤治疗的作用。
1.3 诱导肿瘤细胞周期阻滞
细胞周期由细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs）共同调节。调节细胞周期的复杂机制已在酵母和哺乳动物细胞中得到广泛研究，并已鉴定出 20 多个 CDK。其中，CDK1、2、4 和 6 在细胞周期进展中起主要作用，这一过程在癌细胞中受到高度干扰[38]。目前，针对细胞周期的靶向治疗是一项具有潜力的肿瘤治疗策略。
虫草素诱导肿瘤细胞周期阻滞，然而虫草素对于不同肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用不同[39-47]。在一些研究中，虫草素使肿瘤细胞阻滞在 S 期。在白血病细胞和胰腺癌细胞中，虫草素可以下调 CDK2 的表达，同时显著降低周期蛋白 E 和周期蛋白 A2 的水平，由于 CDK2 是 G1/S 期过渡和 S 期的进展过程中必需的激酶，因此肿瘤细胞阻滞在S 期[25,43]。Wang 等[48]发现虫草素对胆管癌细胞 NOZ 和GBD-SD 进行治疗后切割 caspase-3、切割 caspase-9、切割PARP 和 Bax 表达显著上调，而 Bcl-2、cyclin A 和 CDK2表达显著降低；
虫草素治疗降低了 G0/G1 期细胞的数量，而 S 期细胞比例明显升高，表明虫草素以剂量依赖性的方式将胆管癌细胞阻滞在 S 期。
而在其他一些研究中，虫草素使肿瘤细胞阻滞在 G2/M期。在人膀胱癌细胞和人结肠癌细胞中，虫草素通过上调P21WAF1 基因，抑制细胞周期蛋白 B1/CDC2 表达，使肿瘤细胞阻滞于 G2/M 期[29,49]。在HeLa 细胞中，虫草素通过检查点激酶 1（checkpoint kinase 1，CHK1）/周期蛋白B1-CDC2 复合途径促进 G2/M 期阻滞[50]。虫草素在食管癌细胞中显著抑制 p-ERK 的表达，使得 MAPK 通路失活导致 cyclinB 和CDK1 水平升高，从而导致 G2/M 期阻滞[51]。
肿瘤转移是肿瘤细胞从原发部位分散并逐渐在远处器官定植的过程。在超过 90% 的病例中，肿瘤细胞的转移扩散是肿瘤病人死亡的最大原因[52]。而上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤转移中起着至关重要的作用。已知包括 TWIST1、SLUG、SNAIL1和 ZEB1 在内的一组转录因子（transcription factors，TF）参与调节 EMT[53-54]。在三阴性乳腺癌中，一项研究发现TWIST1、SLUG、SNAIL1 和 ZEB1 在小鼠乳腺癌细胞4T1 中很容易检测到，并且经过虫草素治疗后它们在转录水平显著下调，因此该研究提出虫草素通过调节 SLUG、TWIST1、SNAIL1 和 ZEB1 转录因子的表达，抑制三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭[55]。
一项研究表明[56]，虫草素在侵袭实验和伤口愈合实验中显著抑制人类胶质母细胞瘤细胞系 U87MG 和 LN229的迁移，同时可以降低整合素 α1、黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）、磷酸化 FAK 蛋白表达，推测虫草素通过影响溶酶体的降解和蛋白磷酸酶的激活抑制人胶质母细胞瘤细胞的侵袭和转移。先前的研究表明，CXC 趋化因子受体 4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）在肝癌组织中高表达，并且肝癌细胞优先转移到具有大量表达CXCR4 配体基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF1）的器官和组织[57]。在 Guo 等[58]的研究中，虫草素通过下调 NF-κB 抑制剂 α（NF-κB inhibitor α，IκBα）的磷酸化来抑制 p65 的活化和核转位，从而下调 CXCR4，抑制肝癌细胞的体外迁移和侵袭。
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）作为一种结构和功能相关的内源性蛋白酶家族，参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解。研究表明，MMPs参与肿瘤发生、侵袭和转移；
抑制 MMPs 可能在预防肿瘤和阻断肿瘤转移方面具有价值[59]。在人肺癌细胞[60]和人口腔鳞癌[61]中，观察到虫草素使 MMP-9 活性降低并对肿瘤细胞侵袭产生抑制。Jeong 等[62]的研究表明虫草素通过下调细胞紧密连接（tight junctions，TJs）和 MMPs 的活性来抑制人前列腺癌细胞 LNCaP 的侵袭和转移，并且这可能与抑制 AKT 活化有关，同时经过虫草素治疗后组织金属蛋白酶抑制剂 1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1，TIMP-1）和 TIMP-2 的表达水平增加，从而调控肿瘤转移。由于虫草素具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移的功能，使其在肿瘤治疗中更有潜力。
目前，多项研究将虫草素与多种治疗策略联合，以期改善对肿瘤的治疗效果。肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性是有效化疗的主要障碍，肿瘤细胞的耐药性是由多种机制引起的，包括药物流入减少、药物流出增加和 DNA 修复机制的激活[63]。多药耐药蛋白 1（multidrug resistance protein 1，MDR1）是一种跨膜活性转运蛋白，不仅在识别化疗药物方面发挥重要作用，而且还会将药物泵出，对细胞内部进行解毒。靶向 MDR1 等活性药物转运蛋白可以使肿瘤细胞对化疗药物再敏化[64]。有团队探究了虫草素诱导的人膀胱癌T24R2 细胞中对化疗药物顺铂的再敏化机制：MDR1 启动子活性依赖于转录因子 Ets-1，虫草素可能通过对 PI3K 信号的影响，降低 Ets-1 水平从而减少 MDR1 转录，显著降低 MDR1 的表达，诱导膀胱癌细胞对顺铂重新敏感[65]。在食管癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌的多项研究中[66-68]，证明了虫草素和顺铂对肿瘤细胞的协同治疗作用主要是通过上调肿瘤细胞中的 AMPK 信号和下调 AKT 信号来实现的，并且提出了虫草素与顺铂联合应用可能成为提高顺铂耐药肿瘤患者治疗效果的新疗法。在一项表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变型非小细胞肺癌的研究中，发现 EGFR 突变型的肿瘤细胞对虫草素更敏感，并且证明虫草素通过激活 AMPK 及下游通路，在体内外促进非小细胞肺癌细胞的凋亡，提出虫草素单药或与目前可用的靶向疗法结合可能是 EGFR 突变型肺癌的额外选择治疗方法[19]。
此外，多项研究证实了虫草素与放疗联用的可能性。虫草素可通过延长 G2/M 期阻滞和延长双链DNA 断裂时间来增强口腔癌细胞的放射敏感性[69-70]，潜在的分子机制可能与 DNA 损伤修复相关的蛋白表达下调有关，包括磷酸化的共济失调毛细血管扩张突变（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）和磷酸化的 CHK2。有研究证明虫草素通过激活外源性和内源性 caspase 途径、细胞周期停滞和内质网应激来增强 MA-10 小鼠睾丸间质瘤细胞凋亡的放射敏感性，并且提出使用虫草素联合放疗治疗睾丸癌，可以通过减少治疗剂量达到相同的治疗效果，避免长期毒性，减少对睾丸功能的影响[39]。
由于虫草素进入体内后，会被广泛存在于组织中的腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）快速水解，因此被输送到肿瘤部位的药物极少。对虫草素的结构进行修饰，选择高活性、高稳定性和高生物利用度的新化合物对提高虫草素的疗效具有重要意义。在一项研究中成功地开发了三种形式（CS、CMP 和 CMA）的虫草素负载木薯淀粉纳米颗粒（cordycepin-loaded cassava starch nanoparticles，CCSNPs），有助于防止虫草素在小肠吸收前丧失功能，并且这些纳米颗粒可以通过刺激活性氧产生和减少蛋白分泌来抑制口腔癌细胞的生长，还可以阻止某些与肿瘤相关的细胞酶被破坏[71]。最新一项研究使用 ProTide 技术，开发了一种基于虫草素的新型抗癌药物，这种药物在肿瘤细胞内产生高水平的活性代谢物，其效力是虫草素的 40 倍[72]。此外，在该药的 I 期临床试验（NCT03829254）中，目前还没有观察到核苷类似物常见的副作用（包括贫血、白细胞减少和血小板减少），并且该药展现了很好的抗肿瘤效果，该研究团队将开展 II 期临床试验。这表明通过将 ProTide 技术应用于虫草素，其生物利用度得到增强，保留了固有的作用，且毒副作用小，但是其具体机制仍需进一步研究[72]。
虫草素作为一种腺苷类似物，具有多种药理活性。在抗肿瘤治疗中，虫草素诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，同时又阻滞肿瘤细胞周期，并且抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。虫草素的抗肿瘤效果是多方面多路径协同作用的，但是目前由虫草素诱导的各个信号通路之间的交互作用尚未完全阐明，有待深入研究。
虫草素有望成为一种有前景的抗肿瘤联合治疗药物，目前的研究热点主要集中于将虫草素与化疗药物联合使用或与放疗联合。然而，发现虫草素在肿瘤治疗中存在的其他未知分子机制并了解其治疗潜力将对联合疗法的施行非常重要。同时，探索利用纳米生物技术介导虫草素的靶向给药以及如何提高虫草素的生物利用度也同样重要。目前仍然需要进一步的实验和临床研究来确定虫草素在单独和联合使用过程中的疗效和安全性。
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