云南栘,总DNA,提取方法比较及SSR,反应体系优化*

文章来源：网友投稿时间：2023-08-22 08:05:03

张新洛，彭劲谕，王玉昌，王大玮

(1.西南林业大学林学院，云南昆明 650224；
2.中国农业大学农学院，北京 100000)

随着现代生物技术的快速发展，利用分子遗传改良技术对云南栘的种质资源进行保护与利用是必然趋势，而高质量的DNA 提取是从分子遗传水平研究云南栘的前提。近年来，植物总DNA 提取的主要方法有CTAB 法[11]、SDS 法[12]、高盐法[13]以及各品牌试剂盒法[13]，但不同物种的提取方法有所不同。云南栘组织细胞中含有大量的多酚和多糖等次生代谢产物[14-15]，多糖易与DNA 结合形成胶状物质，多酚易与DNA 产生不可逆的结合，极易氧化褐变，严重影响了总DNA的提取[16-17]。SSR 标记是以PCR 为基础的一种分子标记技术，该技术具有数量丰富、检测简便、多态性强、重复性高和共显性遗传等优点，被广泛应用于果树育种研究[18-22]。

1.1 材料

1.2 DNA 提取方法

CTAB 法参照刘钰娇等[11]的研究；
SDS 法参照侯泽菁等[12]的研究；
MAGEN 试剂盒法(MAGEN HiPure SF Plant DNA Kit)和磁珠试剂盒法(Wolact®Magnetic beads Plant DNA Purification Kit)按照试剂盒说明书操作；
尿素法和改良尿素法均参考李军等[23]的研究，并在裂解液中添加PVP (2%)和NaAC (1.4 mol/L)。

1.3 DNA 质量检测

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测

1.3.2 超微量分光光度计检测

用移液枪吸取DNA 1 μL，使用超微量分光光度计(Thermo NanoDrop2000)检测其质量浓度并查看260 和280 nm 的吸光度值A260和A280；
利用SPSS 23.0 对6 种方法提取的云南栘叶片总DNA 质量浓度、纯度和试验时间等数据进行方差分析和多重比较。

1.4 SSR-PCR 反应体系建立

引物来自PENG 等[24]的研究。从18 对SSR 引物中随机选出引物TRINITY-244 (F：5′-CTCGATCGCTTCTCTTCTATT-3′，R：5′-ATACGACCGACAGGGAAT-3′)，退火温度为58 ℃，用于优化后体系扩增的稳定性验证。引物由Sangon 生物工程技术公司(中国上海)合成。

在25 μL 的SSR 反应体系中，通过设立5 因素4 水平正交试验(表1)，观察不同模板DNA 质量(30、60、90 和120 ng)、TaqDNA 聚合酶含量(0.2、0.3、0.4 和0.5 U)、引物浓度(0.50、0.75、1.00 和1.25 μmol/L)、dNTPs 浓度(1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L)以及Mg2+浓度(0.5、1.0、1.5 和2.0 mmol/L)对扩增效果的影响，试验设3 次重复。

表1 SSR 反应条件正交组合Tab.1 Orthogonal combination of SSR reaction conditions

1.4.1 PCR 反应程序及产物检测

PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环，72 ℃后延伸10 min，PCR 产物于4 ℃保存[25]。PCR 扩增产物使用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.4.2 SSR-PCR 反应体系验证

采用优化构建的SSR-PCR 反应体系对来自不同居群的30 个云南栘个体(表2)进行验证，检测扩增得到的产物，检测方法同1.4.1 节。

表2 云南栘采样地地理信息Tab.2 Geographic information of Docynia delavayi sampling sites

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

由图1 可知：6 种DNA 的提取方法中，只有改良尿素法提取的DNA 质量最好，条带单一、完整、无污染；
使用尿素法、磁珠试剂盒法和CTAB 法提取的DNA，虽然能看到条带，但条带不清晰、不明亮，存在一定程度的弥散现象，点样孔残留有一定的杂质且存在降解现象；
使用MAGEN 试剂盒法及SDS 法提取的DNA 较差。

图1 6 种方法提取的DNA 电泳图Fig.1 Electrophoretogram of DNA extracted by six methods

2.2 超微量分光光度计检测结果

表3 6 种方法提取总DNA 的质量浓度、纯度与试验时间Tab.3 Mass concentration,purity and experimental time of total DNA extracted by six methods

2.3 SSR-PCR 扩增检测结果

由图2 可知：16 个组合的扩增结果有明显差异。所有组合中，除组合7 和12 未扩增出条带外，其余组合均能有效扩增；
在能有效扩增的组合中，组合3、4、5、6、11、15 和16 的条带明显优于其他组合；
再次检测这7 个组合发现：组合4的条带清晰、杂带少、稳定性高，因此将组合4 选为最佳组合，即在25 μL 的PCR 体系中，含模板DNA 30 ng，dNTPs 2.5 mmol/L，Mg2+2.0 mmol/L，TaqDNA 聚合酶0.5 U，引物1.25 μmol/L。

图2 正交试验PCR-SSR 反应体系的扩增结果Fig.2 Amplification results of PCR-SSR reaction system by orthogonal experiment

2.4 SSR-PCR 最佳反应体系验证

由图3 可知：优化的SSR-PCR 反应体系对30 个云南栘个体的扩增条带均清晰无拖带现象，多态性强，同时具有较好的稳定性和重复性，可以应用于云南栘的遗传多样性研究。

图3 SSR-PCR 优化反应体系对30 个云南栘样本的扩增结果Fig.3 Amplification results of SSR-PCR optimization reaction on 30 samples of Docynia delavayi

高质量DNA 是进一步开展遗传多样性分析等研究的重要基础[26]。本研究采用6 种方法对云南栘DNA 进行提取，琼脂糖凝胶电泳结果显示：尿素法、磁珠试剂盒法和CTAB 法所提取的云南栘DNA 条带不明显，DNA 质量不高，推测原因是这3 种方法不能有效去除叶片中糖类、蛋白质和酚类物质[27-28]；
MAGEN 试剂盒法和SDS 法凝胶电泳结果显示无条带，表明无法有效提取DNA，推测原因可能是试验时间太短导致没有有效提取DNA[29]；
采用改良尿素法对云南栘叶片DNA 提取的效果最为明显，其原因是该方法不仅可以有效阻止细胞中多酚和多糖类等物质与DNA 结合[30]，而且能使DNA 更充分地溶解在溶液中[31]，提高DNA 的提取质量。这与同科植物梨(Pyrus)的DNA 最优提取方法不同[32]，说明同科不同物种因其所含化学成分不同可导致DNA 的提取方法有差异。此外，改良尿素法提取的DNA 符合后续SSR-PCR 反应体系的要求，为后续分子试验奠定基础。

建立稳定的SSR-PCR 反应体系是进行遗传图谱构建及多样性分析、亲缘关系鉴定、种质资源保护及利用的重要基础[33-37]。本研究采用正交设计试验建立SSR-PCR 反应体系，与其他利用单因素试验所建立的反应体系[38]有一定差异。与传统的单因素试验相比，正交设计试验不仅能够分析各影响因子之间的作用[39]，而且能够解决单因素试验过程中持续时间长和过程繁琐的问题[40]，该方法不仅具有省时、省力和省物等优点，而且能够筛选最优组合，提高试验效率[41]。本研究采用L16(45)正交试验设计建立云南栘SSR-PCR 反应体系，与苹果[42]、山梨[43]和树莓[44]的SSR 反应体系有所差异，说明不同物种的最优SSR 体系有所不同。SSR-PCR 扩增出的条带是多种影响因子多重交叉作用的结果[45]，不同物种SSR 反应体系差异很大。SSR-PCR 反应体系受到模板DNA、Mg2+、引物、TaqDNA 聚合酶和dNTPs 的影响[46]，因此使用适合的方法确定各个影响因素的最佳浓度和用量是云南栘SSR 体系优化的关键[47]。

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